HPLC " fast analysis "

작년에 일어난 acetonitrile 파동에 따른 경제적문제와 환경오염등의 문제점이 점차적으로 증가 함으로서 과거에 규정했던 각종 시험법에 대한 수정이 불가피하게 되었다.

최소한의 용매의 사용으로 최대의 분석효과를 구하고자 하는 노력이 시도되었고 이에 발 맞추어 각종 컬럼과 기자재등이 시판되고 있다.

미국약전과 식약청 (USP & FDA) 에서는 HPLC를 이용한 분석 규정에 대해 다음과 같은 변경 사항을 지정하고 있다.

위의 표에서 알수 있듯이 몇 가지 예를 들자면 컬럼 길이는 일반적으로 쓰이고 있는 (4.5 X 150mm , 4.5 X 250mm) 의 70%의 길이를 변경 시킬수 있다. 따라서 250mm -> 75mm , 150mm -> 50mm 의 길이의 작은 컬럼을 대체 하여 사용할수 있고 I.D.의 경우 USP에서는 25% , FDA ORA-LAB 5.4.5에서는 50%의 변동이 가능하다.

위의 표에는 나와있지 않지만 Injection volume의 경우 detection limit 과 precision이 맞는 한도 내에서 최소한으로의 사용이 가능하다.

LC에 사용되는 컬럼의 사양을 조절함으로서 얻을수 있는 효과는 다음과 같다.

1. 컬럼 I.D.의 축소  : 사용되는 용매의 절약 , Sensitivity의 증가
2. 컬럼 길이의 축소 : 분석시간 절감 ( 길이만 줄이면 resolution이 좋지 않다.)
3. 컬럼 입자크기의 축소 : 길이 축소에 따른 분해능의 감소를 보완한다. , resolution의 증가.

그리고 분석 조건의 변경을 또 다른 변수로 적용해 보면

4. I.D.의 축소 + flow 일정 :
I.D.가 작을 수록 분리시간은 감소하나 resolution이 좋지 않다.  이때는 flow rate의 감소 + Injection vol.의 감소로서 보완한다.

I.D.변화에 따른 유속 & 주입량의 계산법

Scale flow rate (maintain linear velocity) to stay within USP guidelines.

F2 = F1 X (d2)2  /  (d1)2

예시 : I.D. 4.6 , flow 1ml/min --> I.D. 3.0mm , flow ?
F2 = 1.0mL/min X (2.1)2 / (4.6)2
F2 = 0.43mL/min

당연한 말이지만, 위에 열거한 사양의 변경은 어디까지나 분리능의 최적화에 그 목표가 있다. 즉, 분리능을 유지하면서 최소의 용매사용을 목표로 한다.

적절한 컬럼 선택을 위해 고려해야 할 점들을 보면

1. 3.0mm i.d. 의 solvent saver column ( tubing은 capillary tubing 0.12mm i.d. / red 추천 )

2. Narrow-bore Column (2.1mm i.d. )
-> 검출기 cell volume은 2uL 이하로 사용  
-> 주입되는 시료의 vol.은 제일 처음 나오는 peak의 10%정도 선에서 주입
-> Capillary tubing 0.12mm i.d.

일반적으로 LC/MS의 경우  작은 컬럼을 주로 사용한다. 그 이유는 진공 챔버내에 들어가게 되는 용매의 양을 최소화 하기 위함이다.

Resolution에 대해 추가적으로 이야기해 보자 위에 보이는 그래프는 Van Deemter curve로서 가로축은 linear velocity 세로축은 HETP(이론단높이) 이다 HETP에 대해 잠깐 살펴보면..

where:
Nt	= the number of theoretical plates (also called the "plate count")
H	= the total bed height
HETP	= the height equivalent to a theoretical plate

로서 쉽게 설명하면 HETP의 역수는 이론단수에 비례한다 따라서 HETP가 낮을 수록 분리능의 증가가 이루어진다고 할수 있겠다.

이어서 보면 입자크기가 작아질수록 유속의 증가에도 이론단수는 1.8um의 경우 일정하게 유지됨을 알수 있다.
따라서 입자크기와 분리능의 관계는 반비례한다라는 것을 유추할수 있다.

[ 1.8um particle 을 사용하는 컬럼의 선택에 있어서 고려해야 할 사항은 다음과 같다. ]

1. 고압에서 견딜수 있는가
2. 여러 사양의 고정상이 제공되는가
3. 다양한 길이와 i,d.가 제공되는가
4. 장비의 규제가 적은가

Agilent에서는 1.8um의 입자컬럼으로 RRHT ( Rapid resolution High Throughput / 600bar까지 사용) Column RRHD ( Rapid Resolution High Definition /1200bar까지 사용)  Column 을 제공하고 있다.

분리능 증가의 다른 요소는 ECV의 감소 (Extra column Volume) 가 있다 이것은 마치 오픈 컬럼에서 샘플 Vol의 차이에 비유할수 있다. vol이 많으면 컬럼내에서 보다 확산이 많이 일어나게 되어 analyte A , B의 차이가 적어지고 심하면 겹치게 되는 경우가 발생한다. Void volume의 증가는 resolution의 감소를 야기한다. 
ECV 는 sample vol + connecting tube vol + Fitting vol + detector cell vol을 이야기 하며 심지어 컬럼과 tubing 사이의 nose의 길이 차이에 의해서도 발생한다. 따라서 column 내경과 길이의 변경에 따라 tubing의 교체 또한 고려되어야 하는 요소이다. 

마지막으로 분리능의 증가에 관여하는 것은 Data rate의 조정이다. 같은 시간에 검출하는 비율을 이야기 하는 것으로서 rate의 증가는 peak 모양과 resolution이 좋아짐을 의미하지만 baseline noise도 따라서 증가하므로 적절한 조정이 필요하다. 

정리해보면 고효율 + 빠른 분석을 이루기 위한 요소는 다음과 같다.

1. 짧은 컬럼 길이
2. 작은 입자 크기
3. 최적화된 LC-system 


 

<References>
영화과학 세미나 자료
www.chem.agilent.com/en-US/Produ...nID.aspx
Wikipedia

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