IONIC SAMPLES : RP , Ion-pair and Ion-exchange HPLC

1 . Ionic sample (Ionic solute)
: 1개 내지 그 이상의 acidic 하거나 basic한 성질을 지니는 작용기를 갖는 molecule을 의미한다.
이러한 성질은 silica-based column의 경우 pH range 2~8 , pH-stable column의 경우 1~14사이에서 완전히 이온화되는 것을 의미한다.

1-1 Acid/Base Equilibria & RP retention
역상 컬럼에서 solute의 성질이 소수성일수록 더 큰 머무름 시간을 갖게된다. 역상에서 산(HA) 또는 염기(B)가 이온화된 상태라면
훨씬 작은 소수성(바꿔말하면 친수성)성질을 갖게되어 결과적으로 머무름 k 값이 10-20배 줄어든다.

HA  , B + H+  ----> Hydrophobic (More retained in RPC)
A- + H+ , BH+ ----> Hydrophilic (Less retained in RPC)

[ pH가 증가할수록..]
(1) Acid 는 proton을 잃게 되며 (그리고 이온화된다)
[pH가 줄어들수록...]
(2) Base는 proton을 얻게 된다. (그리고 이온화된다.)
=> pH의 저->고 상태의 이동은 산과 염기의 머무름 부피의 변화를 가져오며 용출순서를 예로 들면
A(acid) B(ase) N(eutral) 의 경우에...

low pH :   B - A - N
High pH :  A - N - B

염두해야할 점중에 하나는 pH=Pka인 경우 절반만이 이온화된다는 것이다. 대부분의 pH에 따른 머무름 시간의 변화는 pKa +- 1.5 범위 내에서 일어난다. 이 범위를 초과한 pH의 경우 (크건 작던) compound는 이온화되거나 그렇지 않은 상태로 존재하며 그 이상의 pH에 변화에 별로 다른 어무름 시간의 변화를 나타내지는 않는다.

1-2. Buffer의 선택

산염기적 성질을 가지는 sample의 경우 버퍼의 사용이 강력히 요구된다. pH의 조정은 pH meter를 주로 사용하는데, 수용액이 아닌 유기용매가 들어간 경우 나타내는 pH는 정확하지 않다. 주로 추천되는 방법은 유기용매를 가하기 전 수용액 상태에서 pH를 조정하는 것이다. 이 방법은 유기용매가 들어간 후의 pH를 알기에는 적합하지 않지만 들어가고 난뒤 측정하는 것보다는 추천되는 방법이다.

특정 버퍼의 선택에서는 다음과 같은 고려사항이 있다.

(1) Buffer capacity
(2) UV absorbance
(3) 다른 특징 (용해도, 안정도 sample과 column의 상호작용 , 휘발성 , HPLC system에 대한 부식성.. and so on.)

1-2-1. Buffer capacity

완충 용량은 [1] pH [2] bufer pKa [3] buffer concentration에 의해 결정된다. 
as for(에 관해서,는 어떠냐면) 

 

Buffer capacity is a quantitative measure of the resistance of a buffer solution to pH change on addition of hydroxide ions. It can be defined as follows.
buffer capacity =

where dn is an infinitesimal amount of added base and d(pH) is the resulting infinitesimal change in pH. With this definition the buffer capacity can be expressed as^[3]

where K_w is the self-ionization constant of water and C_A is the analytical concentration of the acid, equal to [HA]+[A^-]. The term K_w/[H⁺] becomes significant at pH greater than about 11.5 and the second term becomes significant at pH less than about 2. Both these terms are properities of water and are independent of the weak acid. Considering the third term, it follows that

1. Buffer capacity of a weak acid reaches its maximum value when pH = pK_a
2. At pH = pK_a ± 1 the buffer capacity falls to 33% of the maximum value. This is the approximate range within which buffering by a weak acid is effective. Note: at pH = pK_a - 1, The Henderson-Hasselbalch equation shows that the ratio [HA]:[A^-] is 10:1.
3. Buffer capacity is directly proportional to the analytical concentration of the acid.

버퍼의 이온화는 버퍼의 pKa-+1 에서의 pH의 범위에서 이루어 진다. 다시말하면 이 범위에서 버퍼는 완충능을 가진다는 말이다.
따라서 보다 안정적인 실험을 위해 특정 분리에 이루어 지는 pH의 범위는 +-1의 범위에서 조작을 수행한다. 일반적인 RPC 분리에서는 10~50mM의 버퍼농도가 적절하다. 높은 버퍼의 농도는 버퍼용량을 늘리는데는 적합하지만 높은 B%에서의 sample의 용해가 잘 이루어지지 않을수 있다. 또한 기기자체의 부식에도 영향을 미칠수 있다.
반대로 낮은(marginal) 농도의 버퍼는 분리 재현성에 있어 낮은 경향을 보이며 피크 모양의 불균형등을 초래한다.. 이것은 compound의 부분적 이온화에 기인한다.


1-2-2. UV 흡광

In theoretical physics, cutoff is the maximal or minimal value of energy, momentum, or length, so that the objects with even larger or smaller values than these physical quantities are ignored. It is usually represented within a particular energy or length scale, such as Planck units.

An infrared cutoff (long-distance cutoff) is the minimal value of energy - or, equivalently, the maximal wavelength (usually a very large distance) - that the human eye takes into account. On the contrary, an ultraviolet cutoff is the maximal allowed energy or the shortest allowed distance (usually a very short length scale). If some quantities are computed as integrals over energy or another physical quantity, these cutoffs determine the limits of integration. The exact physics is reproduced when the appropriate cutoffs are sent to zero or infinity. However, these integrals are often divergent - see IR divergence and UV divergence - and a cutoff is needed. The dependence of physical quantities on the chosen cutoffs (especially the ultraviolet cutoffs) is the main focus of the theory of renormalization group.

이상적인 버퍼는 낮은 파장에서의 흡광을 위해 220nm혹은 그 아래에서 전도(transmit)이 일어나야 한다. 다양한 버퍼들이 이러한 조건을 충족하고 있다. (e.g. TFA 0.1% 210nm cutoff) 그러나 buffer내 impurity의 존재는 낮은 파장에서 간혹 흡광의 큰 증가를 야기한다.

1-2-2. 다른 버퍼의 특성

Solubility , Stability , interaction between Column..Volatility 등도 고려해야 할 점이다.
phosphate buffer의 경우 유기용액이 고농도로 있을 경우 미미하게 용해한다.
Methanol-water >> ACN-water,THF-water (용해도) 의 특성이 있다. 따라서 methanol은 버퍼와 유기용매의 사용에 있어 가장 첫째로 고려하는 용매이다.

비유기성 버퍼는 대체로 안정하나, 휘발성이 큰 것들은 pH에 있어 불안정하다. (특히 helium sparging실시)

Carbonate buffer의 경우에 지속적인 CO2의 감소로인하여 이동상의 pH는 증가하는 경향이 있다.
TFA는 pH<2.5인 경우 큰 이온화 경향을 보이며 상대적으로 휘발성이 없는 특성이 있다. 따라서 peptide, protein분리에 쓰인다.

몇몇 버퍼는 장기간 보관시 지속적으로 degrade하며 UV흡광을 증가시킨다. (e.g. TFA , TEA(Triethylamine))

Citrate buffer는 stainless steel에 부식성을 보이나. 하루 working이 끝나고 HPLC 내부의 버퍼를 flushing해주면 사용하는데 문제가 없다고 하기도 한다. 허나 이 버퍼의 큰 단점은 UV흡광도가 높다는 것이며 그 수치는 230nm정도이다. (cutoff 를 의미...?)

어떤 버퍼는 sample자체와 반응 하는 ion-pair의 효과를 나타낸다. ( TFA+cationic sample , TEA + anionic samples)

[ per se : 그 자체로는 ] ion-pair 상호작용은 그 자체로는 선호되는 방법은 아니다. 때때로 조건의 변화에 따른 chromatogram의 해석에 난해함을 초래하기 때문이다.

휘발성을 가지는 버퍼는 2가지 이유로 선호되기도 하는데 첫째는, 휘발되는 특성상 rotary evaporator , lyophilizing등으로 제거 할수 있어 그 순도(fraction)에 별다른 영향을 끼치지 않는다. (e.g. Ammonium acetate , ammonium formate , ammonium carbonate , TFA) 둘째는  특정 detector에 적합하다.(ELSD, mass-spectrometer)

1-2-2. 선호되는 버퍼

일반적인 RPC column은 C8 , C18을 사용하며 이것의 stability는 2<pH<8범위내이다. 따라서 버퍼또한 이 범위내에서 조제를 해야하며 파장 210nm 또는 그 이하에서 디텍션이 되도록 해야 한다.
column product에 따라 이 범위는 달라질수 있으니 메뉴얼을 참고하자.


1-3.  Pka as a function of compound structure

이동상 pH의 최적화가 완료되면 다양한 sample의 대략적인 Pka를 알 필요가 있다. 반대로 target의 구조를 아는 경우 Pka값을 다양한 방법으로 유추할수 있는데 이것과 관련된 program도 시판되고 있다. (e.g. Compudrug)

참고 자료등에 나와있는 Pka에 대한 table을 참고 할때는 다음과 같은 사항에 유의해야 한다.

1. 관능기의 Pka값은 인접한 다른 관능기에 의한 전기음성도에 의해 다양하게 변화될수 있다.
(예를 들면 같은 -COOH기를 가진 acetic acid 와 TFA의 pKa 값은 각각 4.8 , 0.7이다.

2. 이동상에 유기용매를 첨가하는 경우 역시 pH , pKa값은 변화한다.
( 몇 가지 case는 이러한 사실을 뒷받침한다. 예시는 ...)
- Pyridine 유도체의 Pka 값은 10% 의 MeOH , ACN ,또는 THF의 첨가에 의해 0.1~0.3 unit의 PKa값이 감소하였다.
- Anilinium derivatives같은 염기의 경우 0,3 units/10% added MeOH 의 pKa값이 감소하였다.

compound의 산과 염기도, pKa 등은 pH의 조건 변화로 예측할수 있다.  다시 말하면 pKa = pH 일 경우 머무름은 극단적인(between highest and lowest) pH값 사이에서 중간을 나타내는 성질을 이용한 것이다.

예를 들어보자 왼쪽 그림에서의 base의 pKa value는 7임을 유추할수 있다. Acid의 경우 pKa value는 4임을 알수 있다. (만약 이 곡선의 변곡점을 알수 없을 경우에 즉, "ㄴ"형태를 보이면 pKa < 4 라고 유추한다.

더불어 왼쪽 그림에서 보면 Base와 Acid의 pH에 증가에 따른 Retention의 역전이 일어나는 것도 알수 있다. (describe











1-3-1. 선호되는 이동상의 pH
가장 흔한 산 또는 염기의 관능기는

[1] Amine( -NH2 , -N(CH3)2..and so on...)
[2] Carboxylic acid ( -COOH )

그룹이다. 수용액 상에서의 Aromatic amines , Pyridines , aromatic // aliphatic carbixylic acid의 pKa 범위는 대략 4~5이다.
( 반면에, aliphatic amine : pKa= 8 ~11 )

따라서 aliphatic류의 pH에 따른 머무름의 변화는 알킬 아민류보다 pH 3~6 범위에서 찾을 수 있다.....?
 
Method적인 측면에서 peak의 spacing에 영향을 미치지 않는 범위에서 pH를 조정하는 것이 필요하다.






RPC(reversed phase chromatography) 의 이온성 시료의 분석에서 발생하는 여러 문제점들은 Ion-pair chromatography 상에서도 적용될수 있다.

1. pH 민감성
2. Silanol 효과 (비교적 덜 영향)
3. 온도 민감성 (비교적 큰 영향)
4. peak tracking


(1) 인공적인 피크 발생 (Artifactual peaks)
positive , negative한 peak는 blank test상에서도 관찰된다. ( sample solvent주입시)
LC조건의 확립된 전/후 blank test를 해주는게 중요하다.

인공적인 피크 발생은 일반적으로 이동상과 샘플용액의 조성차에의한 결과로 발생하는데 용매의 오염정도 또한 큰 영향을 미친다.
추천되는 일반적인 방법은 샘플용액과 이동상의 성격을 비슷하게 만들어 주는 (용액의 농도까지) 것이며 여기에 인젝션되는 양또한
적게 (즉, 고농도) 해본다.  vol은 50uL이하.. 문제점이 계속된다면 IP reagent를 바꿔본다.


(2) 느린 컬럼 평형 (Slow Column Equilibration)

(3) 피크 모양의 불균형 (Poor peak shape)

<Reference>
Practical HPLC Method development ( Snyder , Kirkland , Glajch ) 내용 정리
Wikipidia , http://en.wikipedia.org/wiki/Buffer_capacity