Ion-pair chromatography

IPC라 불이우는 Ion-pair chromatography 와 RPC는 많은 특징들을 공유한다. 차이점이라 하면 이동상에 Ion-pair reagent를 첨가하는 것이 대부분이다. IPC를 쓰기전에 유의해야 할 점은 앞서 설명한 RPC에 대한 분리를 충분히 수행하고, 그럼에도 불구하고 band spacing등을 개선하지 못할때 적용하야 한다는 것이다.(additional option의 성격) 왜냐하면 IPC의 경우 method development에 있어 복잡하며  기존 RPC에서 보지 못한 문제점들을 야기한다.

예를 든 figure를 여기서 다 그리고 설명할수는없으므로, 요점만 이야기 하면.
일반적인 RPC의 pH범위 2<pH<8 내에서 이온화 억제를 시키지 못하는 것들..(강한 염기같은..) 에 적용할수 있다.
강한 염기의 경우에 anionic reagent를 첨가하여 cationic band에 대한 선택성을 강화시킨다. 여기서든 예는 이 방법을 씀으로서 socratic을 적용하지 못하는 조건을 isocratic을 적용할수 있게 조정했다고 결론 짓고 있다.

1-1 Basis of retention

Ion-pair reagent의 알킬 그룹의 특성으로 인해 소수성의 RPC packing에 일종의 cover가 이루어진다. (hexane sulfonate의 경우 C6-SO3-) 따라서 고정상은 음이온의 이불을 덮고 있는 형상을 이루며 이 음이온은 reagent 혹은 buffer내의 sodium과 평형을 이룬다. 여기에 sample이 주입되고 (protonted base BH+) 나면 기존에 있던 sodium과 Ion-exchange 과정을 진행한다. 결과적으로 이온교환 과정을 통해 sample의 머무름 변화가 나타나게 된다.  

1-1-1 pH and Ion-pairing

IPC의 보다 자세한 예를 들어보자. sample : acidic(anionic) RCOOH , Ion-pair reagent : TBA+(tetrabutylammonium)/양이온하전
기존의 RPC 분리에 있어 산성시료의 머무름은 pH가 낮을 수록 최대점에 가까우며 높아 질수록 낮아진다. TBA의 이동상에 대한 첨가로 인해 고정상은 완전한 cover를 하게되고, 따라서 중성 RCOOH의 머무름은 최소가된다. 그러나, 결과적으로 RCOO-에 대한 강한 결합으로 높은 pH상에서 강한 머무름 효과를 나타내게 된다. 따라서 적절한 ion-pair reagent의 첨가로 보다 효율적인 분리를 수행할수 있게된다.

1-1-2 Ion-pair reagent Concentration

고정상에 흡착되는 Ion-pairing reagent의 양을 변화시킴으로서 RPC의 이온교환분리로부터의 머무름을 변화시킬수 있다.
이것은 이동상 내의 reagent의 농도를 바꿈으로서 효과를 나타낸다. Sulfonate reagent P-가 흡착된 C18 column이 있다고 가정하고,2가지 종류의 reagent인 C6-slfonate , C8-sulfonate (앞서 설명했지만 이 시약들은 알킬 chain을 가지고 있다.) 를 각각 쓴다고 해보자, column의 흡착은 이동상 내의 시약의 농도가 많을 수록 증가한다. 그러나 시약에 의한 포화상태가 되면 더 이상 흡착은 일어나지 않는다. C8-type의 경우 더 포화가 빨리 일어나는데 이것은 알킬 체인의 증가로 인한 소수성의 증가효과로 컬럼에 더 잘 흡착이 일어나기 때문이다. 따라서 C6-type보다 적은 농도하에서 포화를 시킬수 있다고 생각할수 있다.
시료의 머무름은 고정상에 흡착된 시약으로인한 charge에의해 최초로 결정된다. 따라서 같은 molar 흡착정도가 조정될경우 C6 , C8각각 비슷한 머무름 효과를 나타낼것이다.

다음으로는 sulfonate ion-pair reagent 농도의 변화에 따른 머무름의 정도를 살펴보자, 이온성이고 친수성 시료인 BH+ 의 경우, 컬럼상의 하전된 정도의 증가는 k값의 증가를 가져온다. 컬럼이 시약에 의해 포화상태에 이르면 머무름 효과는 수평으로 변한다.(maximum) 시약농도의 증가는 대이온(여기서는 Na+)의 증가를 일으킨다. sodium은 이동상내의 시료의 이온과 경쟁을 하며 머무름 효과에 관여한다. 따라서 머무름은 시약농도가 증가함에 따라 최고점에 이르게 된다. IPC method에서 시약농도는 보통 0에서부터 시료의 상대이온의 머무름이 최대가 죄는 지점이 되는 농도까지 변화시킨다. 이 방법은 넓은 범위에서의 선택적인 분리에 적용되며 불필요한 시약의 쓰임을 절약하게 하는 효과가 있다.

pH와 Ion-pair 시약농도의 변화가 동시에 일어난다면, 머무름 간격과 피크 간격 모두를 잡기위한 상당한 조작을 해야한다. 이것이 RP 와 ion-pair(ion-exchange) 과정의 동시 머무름의 결과이다(?)

컬럼에 의한 시약의 흡수에 따라 이온교환머무름은 더욱 중요성을 띠게 된다. 그리고 RP-머무름은 상대적으로 덜 중요하게 된다.
Ion-pairing의 유무에 따른 예를 들면 non-ion pairing의 경우 낮은 pH에서는 머무름의 증가 , 높은 pH에서는 머무름의 감소를 나타내는 곡선을 그리게 될때 1mM TBA 의 첨가로 높은 pH에서도 앞의 예에 비하여 높은 머무름의 증가를 꾀할수 있게 된다.
( "ㄱ" 곡선이 완만한 평행선을 그리게 되는 것과 비슷하다. x-axis: pH , y-axis : log k )

1-1-3 Ion-pair reagent Type


예시로서 설명하면 양이온 염기 (Adr+) , 음이온 산 (NpS-) , 중성 compound ( BzOH) 의 3가지 타겟을 가지고 ion-pair 비교 효과를 보자. ion-pair를 주지 않을 경우 peak order는 [[ Adr+ -> BzOH -> NpS- ]] 순서로 용출되었고 , Adr+의 경우 k=0으로서 머무르지 않고 바로 용출되었다. 나머지 compound는 k=5로서 적절히 머물렀다.

Adr+ ( adrenaline ) , BzOH ( Benzyl alcohol ) , Nps- ( Naphthalene sulfonate )
C18 column , 20% MeOH buffer( 20mM phosphate pH 6 ) 25'C

여기에 14mM의 octane sulfate 를 ion-pair reagent로서 이동상에 가하였다. ( 1.6umol/m2 uptake by column )
결과는 Nps-  ->  BzOH  ->  Adr+ 순으로 용출되었고 중성인 BzOH는 거의 차이가 없으나 Rt가 약간 앞으로 당겨졌고 2개는 위치가 바뀌는 현상이 나타났다. 이유는 column상의 (-) charge가 Adr+ 을 좀더 머무르게 하기 때문이다. Nps-의 경우 같은 charge로 인해 상대적으로 덜 머무르는 결과로 나타났다.

이번에는 reagent의 종류에 따른 결과 비교를 해보자.
시약 :  C8(Decyl)-   C10(Octyl)-   C12(Lauryl)-sulfates

Rt 를 비교해볼때 3개 compound전부 거의 비슷한 경향을 보였다. (i.e., 같은 분리 결과) 이 결과로서 다른 종류의 ion-pair reagent의 사용으로도 동일한 분리결과를 얻을수 있다는 결론을 얻는다.
C10-reagent의 분리능에 도달하기위해서 C8 reagent의 농도는 많이 C12 reagent의 농도는 적게 필요하게 된다. 몇몇 경우에 있어서 두종의 ion-pair reagent의 소수성은 매우 다르기 때문에 상대적으로 소수성이 적은 시약이 packing을 cover하는 농도가 더 소수성이 시약의 covering 정도를 따라가지 못하는 경우가 있다.  무슨말인고 하니, TFA와 HFBA(heptafluorobutyrate)를 비교했을때 TFA는 HFBA보다 packing에 흡착되는 정도가 작다(소수성이 상대적으로 작다) 따라서 TFA가 HFBA의 능력을 따라갈 만한 농도를 잡기가 힘들다. (여기서의 예로서는 HFBA가 10mM이상의 농도일 경우를 이야기 한다.)


2-1 Initial Experiment
앞서 언급했지만 IPC는 RPC와 비슷한 특성을 지닌다 그말인 즉슨, 처음부터 IPC method를 쓰지는 않는다는 의미이다. 일단 IPC를 쓰기로 언급했다면 이동상에 알맞은 ion-pair reagent의 쓰임을 결정해야 할 것이다. 다른 점에 있어서는 RPC와 같다.
여기서 의문점이 생긴다... " 어떤 ion-pair reagent 를 쓸것인가?" "그 농도는 어떻게 정해야 할것인가?"

오늘날 사용되는 IP-reagent는 대부분 alkyl sulfonates 또는 tetraalkyl ammonium salt를 사용한다. 둘다 210nm이하의 낮은 범위에서 흡광을 나타낸다. 염기성 물질의 분리에 Alkyl sulfates 와 perchlorate(ClO4-)가 때때로 사용된다. 그러나 보통 이런 IPC 시약들은 특별한 장점을 보이지 않는다.

protonated base와 다른 cation의 RT증가의 효과를 가지느 sulfonate는 염기성 물질의 분리에 선택적으로 사용되어야 한다.  
이온화된 산과 다른 anion의 RT증가를 꾀하는 Tetraalkylammonium salt는 산성 물질의 분리에 사용된다.
산과 염기의 혼합(중성물질이 포함)된 샘플에 적용될 IPC시약은 최초 chromatogram에 의해 선택한다.

반대의 전하를 가지는 IPC-reagent를 섞는 방법은 기대하지 않은 결과를 줄수도 있다. 두 IPC-reagent는 상호작용함으로서 sample머무름에 관한 효과를 중성화 시키는 경향을 보인다. 한 연구에서는 Cetyltrimethylammoniom(CTMA)와 Dodecanesulfonate(DS)를 염기성 시약의 분리에 동시에 적용하였다. CTMA는 고정상 실라놀기의 효과를 줄인다. 이 연구 결과로는 2개의 IPC-reagent의 사용이 머무름과 감도를 더욱 조정할수 있다고 설명하고 있다.



<Reference>
Practical HPLC Method development ( Snyder , Kirkland , Glajch ) 내용 정리