분리정제론 강의노트 2009 09 16일

note : stahl (swithzeland ->> Itary )

1-[1] Column chromatography

용어 : 기기를 사용하는 경우 (column chromatograph )라고 칭함.

- TLC 로 사전 예비 실험을 하는것이 보통
- 최적의 resin , 최적의 solvent 선택 ( Trial & Error )

[1]-1 Open column

- 대기압 상에서 column chromatograph 실시
- sample 양에 따라 column 크기 결정
- 분리가 어려우면 column length를 증가시킨다 ( 통상, 이게 큰 문제가 되지는 않는다.)

예시>
일반적인 컬럼의 크기 ( Max diameter : 10~12Cm정도 )

( 실리카의 경우 )
1. 컬럼 total volume을 측정 ( V = pi * r^2 * h ) , 주입할 solvent 양을 계산한다.
- H는 diameter의 * 10 <-- 경험치임.

2. resin양은 solvent 의 25% 계산뒤에 g을 붙여준다 8L의 vol의 경우 2L->2kg

3. sample양 resin 질량의 1~4%

( column setting )

[ PACKING ]
-평형자를 이용하여 column 수직을 세워주는게 중요 ( elution이 평형해 지지 않아 각 용리띠가 겹칠 우려가 있다. )
-하단부 cork가 새는지 여부
- packing시에 glass wool , 탈지면을 주로 사용한다. 탈지면의 경우 용매를 부었을때 floating이 생길수 있으니 주의.
(이때 시약용 모래를 약간 덮어주어 이것을 방지하기도 한다.)

- resin크게 (1) slurry (2) dry 상태로 넣어주는데 이것을 sample이나 용리 특성에 따라 선택한다.
- slurry의 경우 resin+solvent 해주어 공기를 제거 한다. (저어주면 공기방울이 올라오는것이 보인다.)
- resin을 컬럼에 넣어주는데 한번에 부어준다.
(resin의 입자가 항상 동등하지 않다,따라서 무거운것은 빨리 내려가고 가벼운것은 위로 뜨기때문에 부분부분 부어줄경우
층이 생긴다.)
- resin을 다 부었을때 컬럼용적의 60%정도 차지하는게 적당하다.
- 용리를 시킬때는 stream형태가 아닌 droplet으로 내려주는게 적당하다.
- dry resin을 사용할때는 무수용매를 쓰지 않는다. 실리카 자체 수분이 함유되어 있으므로 이 수분을 빼앗아 버린다.

flow rate SiO2 350g (10~15mL/hr)
                     1.5kg~2kg (50~100mL/hr)

- SiO2입자가 크면 , 용매가 무거운것 (Chloroform , dichloromethane )일수록 resin의 침강 속도가 크다.

[ LOADING ]

- 실리카의 경우 resin최상부가 평형하고 단단히 굳어진 상태가 되었을때 loading을 실시한다.
(덜 packing되었을때 loading하면 표면이 일그러지기 쉽다.)

note : WALL EFFECT
(resin과 유리관 기벽의 사이가 느슨해져 sample이 새는 현상 , 용리띠가 곡선을 그리는 형태가 된다.)

Sample은 크게 (1) Solid (2) Liquid 두 가지가 쓰인다.
(1) Solid의 경우 sample층의 두께는 가능한 얇게 해주는데 실리카의 경우 (실리카 + Sample 섞어서 건조시킨후 분쇄하여 분말화해서 사용 한다. 섞는비율은 잘 모를때에는 1:1로 섞고 점차 비율을 달리해본다. 점도가 큰 sample의 경우 실리카의 양을 늘린다.)

[ ELUTION ]

elution flow 350g ( 45mL/hr )
                 1.5kg~2kg ( 150~3000 mL/hr )
위 사양은 어디까지나 입자가 굵거나 비중이 큰 용매에서 사용하고 입자가 가늘어 용리가 원활하지 않은 경우는 나오는대로 받는다.

Solvent select
- 에탄올 , EA로 처음부터 column을 만들지 않는다(?) <- 용리액이 잘 나오지 않는다. (단, 혼합용매의 경우는 괜찮다.)
- 용리시에 용매는 항상 흐르는 상태가 유지 ( 상단부, resin전체는 항상 촉촉히)
- 작은 column의 경우 column전체를 돌려주면 기포가 제거되는 효과 기대하기도 함.(packing을 제대로 하면 기포가 자연제거)
- Acyl migration이 발생하기도 한다. ( acyl기가 이동하여 sample구조 자체가 바뀌기도 한다.)
acetate group -> free OH-
- 배당체의 경우 glucuronic acid 의 예, 실리카 자체의 무기이온 불순물에 의하여 salt화가 일어나기도 함.
- 극성 화합물의 분리시에 물 포화 용매를 사용한다(특정 온도에서 포화도 일정하게...온도에 따라 층이 갈라지기 떄문)

note : TLC : Rf value 는 0.2~0.4에서 선택 0.5보다 크면 sample이 용리됨.

Column의 장점은 다량의 sample을 취득(in vivo로 가기 위한...)할수 있기도 하지만 시간과 노력이 많이 필요함..


1-[2] Flash Column chromatograph 

ref : 1978 still J.org chem 43.2923 (1978)

컬럼 상단에 pressure(질소봄베나 공기)을 걸어주어 아래로 밀어내는 효과를 노린다.

- 이때 사용하는 실리카는 9385 particle size 이용 , 너무 고른경우 사용하기 불편.
- EA , petroleum ether 사용 권장.

1-[3] Vacumm Liquid chromatography ( VLC )  - 대략적인 분리시에 유용
ref ; Journal of Natural product 50,790 (1987)
        JOC 44, 4962 (1979)
        JNP 49 934 (1986)

아래에서 압력을 걸어주어 빨아들이는 형식
-  실리카 G를 보통 사용한다.

note : gradient 용어 (1) Linear/선형  (2) step/계단형

2. Gas chromatography
GC-> GLC
ref : Biochem J proc 4.7 (1951)
      Analyst 77.915 (1952)
      1952 Martin , James

- GC는 비극성 물질의 분석에 보다 용이하다.
- Injection , oven , detector 의 3부분으로 이루어져 있으며 detector와 injection의 온도 > oven (25'C정도 상위) 유지한다.
(unless, 막힐 우려가 있다.)
- 너무 고온일 경우 septum(injection부위 막는부분)이 녹는 현상 (bleeding)이 나타나기도 한다.
- injection은 한번에 주입할수 있도록 한다.
- peak 폭이 작을수록 분리가 잘된다.

2-1 Carrier gas
- H2 N2 He Ar등의 비활성 가스를 주로 사용한다.
- detector의 종류에 따라 carrier gas선택한다. (TCD의 경우 He를 사용)

Note :  Thermal conductivity detector (TCD)

The TCD is not as sensitive as other dectectors but it is non-specific and non-destructive

-비활성gas를 사용한다. (활성의 경우 고온시 반응의 우려가 있다.)

-dry gas를 사용한다. ( unless, ghost peak 나타남, 컬럼의 수명 단축 , column의 liquid phase의 반응의 우려)
- pure gas사용( high purity ) , unless noise발생 , base line drift발생

2-2 Column
2-2. 1. packed column
- column소재 : glass , stainless still 사용
- support(담체,지지체) , liquid phase (분리역할) , column으로 구성

2.2 2. support (chromosorb, 상품명 johns manville )
-  W(hite) 흰색 : 규조토 + NaCO3 : 약알칼리성 , 극성성분 분리에 좋다.
-  P(ink) : W보다 견고 다루기 용이 표면 흡착력 강함. , 비극성 분리에 용이
- G : 견고함, 비활성우수 밀도 높고 표면적 작다. piq phase coating에 어려움
- 특수처리 : acid washed , TMS화 시킨것 ( HMDS , DMCS )
note : GC는 일반적인 사용온도범위(약 350℃) 이하에서 기화되지 않는 비휘발성물질이며 열변성이나 열분해를 쉽게 받는 시료는 일반적으로 직접 분리할 수 없다. 그러므로 TMS화(Trimethylsilylation)나 methylation 후 TMS화 등의 전처리가 필요하며 이에 의해 원래 화합물보다 분자량이 많이 증가하게 된다.

Liquid phase + sample = ACN에 evaporated , support에 coating -> column에 충전

2-2 2. Capillary
- 보통 전체 제품화가 되어 있다. 둥근 실리카 원통 안쪽으로 liq phase가 코팅되어 있음.
- Coating 두께(film)에따라 선택 :
...얇은것 0.1~0.3mm, 표준은 0.25~0.5mm 
(소량만이 injection , 녹아내림 현상이 적다. bp높은 물질들, 열에 약한것에 사용 , 감도 좋다.)
...두꺼운것 다량의 sample , liq phase가 많다, 반응시 녹을수있다. 휘발성 강한 sample에 좋다.

note : 컬럼두께가 두꺼워 질수록 oven온도는 낮춘다.

Column길이	화합물수
5~12m	15개 이내
25~30m	15~50개
50m	50개 이상 (isomer혼합)

note : column길이와 분리능 자체는 비례가 아니다. (40%증가 / 2배 길이 ) , 분석시간이 비례하는 경향이 있다. (isocratic의경우)

Injection : split (10%) , spitless (90%) -- 비율조절 (split method )

[ Column의 종류]

-SPB-1
-OV-1
-DB-1 (cross-linked poly dimethylsiloxane , max temp 325'C , amine,phenol,hydrocarbon에 사용)

일반적으로 DB-5 , OV-5 HP-ultra-2 (5% diphenyl + 95% dimethyl siloxane의 co-polymer)
위의 3가지 column은 Max temp 325'C , 일반적 drug , alkaloid , 지방산 methyl ester

DB-17 , OV-17 , HP-50 (50% diphenyl + 50% dimethyl ) , Max temp 250'C , steroid,drug분석

위 6개 공히 오래두면 노화되는 경향  (잘 부러진다.)

[ DETECTOR ]

-FID (일반적) / 불꽃
- MSD ( Mass selective detector)
- TCD ( thermo /잘 사용하지 않음)
- ECD ( electron capture?)
- NPD ( nitrogen phosphorous , N2 P 고감도 검출)
- FPD

최근) NCD ( nitrogen chemi luminesum)
        SCD - sulfur 이용 최근 개발됨.

Retention time : Injection peak ~ Sample peak time
ta :
W : peak width

Column efficiency

N = 16(t1/W)^2