HPLC " TROUBLE SHOOTING "

Trouble shooting 을 하기 위한 첫 번째 단계는 기기 시스템에 대한 이해가 필요하다. 용매(이동상)의 bottle에서 부터 검출기 까지의 흐름을 이해하고 있어야 하며 시스템 각 단계를 하나하나 검토해야 하는 과정 또한 필요하다.

< 분석시 문제점과 관련된 UNITS >

1. Pressure
: Degasser , Pump , Auto-sampler , Column , Detector

2. Retention time
: Solvent , Pump , Column

3. Area value
: Auto-sampler , Detector

4. Peak problem
: Column

[1] Solvent Problem

1. Mobile phase는 항상 Filter 하여 사용한다.
- 일반적으로 0.45uM 필터 사용 ( pump plungers , seals and check valves lifetime의 증가)

2. Filter후 degassing ( baseline의 안정화에 기여 )
- Helium sparging , Sonication , Vacuum filteration
- Sonication의 경우 일반적으로 오래 하지 않는 것을 추천 ( 5min )
- Binary pump << Single pump ( stabled baseline )

[2] Degasser problem
 

- air 제거가 제대로 이루어지고 있는지 check

[3] Pump problem ( pressure/ Rt 이상 )

- Pump seal  마모 : 유량의 불량 (leak) // seal 교체
- Purge valve frit의 오염 : High pressure // Frit의 교체

[4] Injector problem ( pressure // GHOST peak // Area value problem )

1. Roter seal 마모, 오염 // Rotor seal 교체

2. Needle 오염 // Neddle 교체

[5] Detector problem

- S/N 비가 커야한다. , cell vol이 크고 얇고 긴 cell이 좋다.

1. Flow cell 문제 : Baseline 이상
2. Lamp 수명에 따른 area 값 변화

[6] Column Problem

1. 컬럼 오염 : 압력 증가 발생 , 구입시 메뉴얼에 나와 있는 시험법을 시행해보고 비교 (이론단수 , Rt비교)

<> 컬럼 세척 <>
*** 컬럼과 검출기는 연결하지 않는다. ***
1. Mobile phase without buffer salts 
2. 100% Organic ( MeoH , ACN )
( 효과가 없으면 아래로)
3. 75% ACN + 25% isopropanol
4. 100% Isopropanol
5. 100% MC
6. 100% Hexane ( 이후 반드시 IPA 흘림 )

- Sample과 standard는 항상 filteration
Filter size :
0.45um ( 3.5um , 5.0um particle columns)
0.2 um (1.8um particle columns )
Best I.D. is 13~25mm

-Solvent의 용해도 : Buffer와 유기용매가 섞일때 유기용매가 너무 많게 되면 buffer 석출/압력이상의 우려가 있다.
( 사용하는 buffer의 종류에 따른 용해도 고려)

[ Peak shape problem ]

1. peak 가 검출되지 않을때

- 잘못된 Vial

- 잘못된 injection volume (미량주입)
- Injection needle 파손

2. peak의 크기가 예상과 다를경우

 2.1 ( sample syringe 교체 )
- sample syringe 파손으로 인한 sample의 손실
- syringe내 bubble로 인한 sample의 주입량 이상

2.2 ( sample 희석 , injection speed 조절)
- sample의 점도로 인하여 일정량을 injection하지 못할경우

2.3 (detector 점검)
- 감도저하 ( lamp or cell contamination )

3. Broad peaks

- Sample Overload ( 희석 , 주입량 조절 / sample에 따라 농도별 주입량 별 차이가 있다.)
- Blockage column inlet ( Inlet부분의 파손(충진제)으로 앞부분의 peak에 영향 )
- Late eluting peaks ( 이전 과정의 injection 으로 인해 발생 )
- 모든 피크가 broad한 경우
( UV의 경우 data rate 조절해보는 것도 하나의 방법이며 sample solvent의 용매강도 체크한다. 가장 이상적인 것은 이동상에 녹이는것 혹은 이동상과 비슷한 용매 강도를 갖는 용매에 용해시킨다 역상 컬럼에서는 DDW가 가장 이상적)

4. Peak split

- Sample solvent가 너무 강한 용매를 사용함으로서 나타남. 이동상과 비슷하거나 약한 용매를 사용
- 충진제 손상으로도 나타날수 있다.
- Column 오염 ( 세척한다. )
- Void volume ( column을 교체하여 본다. )

5. Peak Fronting

- Injection Disrupting Equilibrium

( 잘 녹지 않는 용매로 sample을 녹여 과량 인젝션 할 경우 나타남. sample녹인 용매를 이동상으로 희석하거나 이동상보다 약한 용매사용)
- Column Voiding ( Column 교체한다.)
- Guard column contamination ( 가드컬럼 교체)

6. Peak tailing

- Column내 secondary interactions
( 이동상을 바꿔서 실험 , Silanol effect로 인해 발생되는 경우가 많다 (염기성 시료와 resin과의 이온교환 현상으로 나타남) pH조절(산성조건)로 시도해본다. 혹은 TEA첨가로 부반응 억제)

** 일반적인 역상 컬럼의 pH조건은 2~8이다 2이하의 산성조건에서는 alkyl chain의 끊어짐 8이상의 염기조건에서는 resin의 용해가 발생될수 있다. ***

- Column 오염 ( 강한 용매로 세정 , 위의 세정법 참고 )
- ECV에 의한 효과 ( 확산효과로 인한것, rotor seal, detector cell vol등을 확인해본다 )

7. Retention time 의 변화

- 시스템 비평형 ( 안정화 시간의 불충분 , gradient실험의 경우에 To값을 고려하여 5분이상 줄것 , ion-pair시약의 사용에는 보다 많은 시간을 안정화에 사용해야 함)

- Pump pressre/Action problems 
( 유량의 불안정은 압력을 변화시킬수 있다.)

- Temperature

- Volume injection 
( sample의 주입량을 줄이거나 희석 , 작은 용매강도의 용액으로 컬럼의 적정 주입량보다 10%정도 더 주입할수 있으나 강한 용매의 경우 1% 정도만 더 사용할수 있다. )

- Solvent blending problems
( 용매의 상호간 섞임성을 파악한다. Miscibility number가 15 이하이면 섞임성이 좋다.)

[참고]
조건의 변화에 따른 머무름 시간의 변화

(1) Flow rate (+/-) 1%        => (+/-) 1% Rt
(2) Temp      (+/-) 1deg C  => (+/-)  1 to 2 % Rt
(3) %Organic (+/-) 1%       => (+/-)  5 to 10 % Rt
(4) pH           (+/-) 0.01%   => (+/-) 0 to 1% Rt

<reference>
영화과학 세미나 자료
www.forumsci.co.il/HPLC/topics.html
chromservis.cz/group/hints-and-t...ang%3DCZ
www.chem.agilent.com/en-US/Suppo...710.aspx