Trouble shooting : Retention problems

 

 

1.    What controls retention?

머무름에 영향을 미치는 요소는 이동상, 고정상, 기기문제, 샘플에 주어진 환경으로 나눌수 있다. 여기서는 샘플에 영향을 미치는 환경, 이를테면 화학적 변화, degradation등과 같은 요소는 배제한다.

 

이동상은 변할수 있다. pH조정이나 부피조정에서 오류가 일어날수 있으며 이러한 이동상에 문제가 예상될 경우 가장 좋은 방법은 이동상을 새로이 제조하는 것이다. 몇몇 이동상은 화학적 변화에의해 degradation이 일어날수 있으며 미생물 증식에 의한 변화, 선택적인 증발 현상등이 일어날수 있다.

 

그림 1 Degradation of acetonitrile residues using oxidation processes

기기문제로 인한 원인이 예상될 경우에는 직접 제조한 이동상으로 비교확인이 필요하다. (isocratic의경우) 혹은 mixing channel의 변경(A,Bpump -> C,D pump)

 

고정상, 즉 컬럼은 일정 수명을 가지고 있다. 시료에 따라 다르지만. 일반적으로 500-2000회의 사용량 범위가 주어진다. 과도한 pH범위에서 사용할 경우 silica based컬럼의 경우 단시간에 수명이 다할수 있다. Cyano 및 amino column은 C8 및 C18에 비해 수명이 짧다. Column이상은 보통 기기압력 증가와 peak tailing을 수반한다. 이러한 문제 발생에서는 컬럼 교체가 가장 쉬운 방법이다.

 

기기문제로 인한 머무름 시간의 변화는 보통 펌프 기능(leaking)을 의심해 볼 수 있다. 펌프 문제는 시계와 volumetric flask를 사용하여 일정 유량에서 받는 부피를 확인 함으로서 그 문제를 가늠해 볼 수 있다.

두번째 증상으로 압력이 높거나 낮고 혹은 진동형태(왔다갔다)하는 경우가 있다. 낮은 유량은 체크밸브의 이상 및 pump seal을 air bubble을 확인하고 높은 유량은 적절하지 않은 방법을 사용하는 경우이다.

 

머무름 시간의 변화를 일으키는 주원인중 하나는 온도이다. 만일 컬럼 오븐을 사용하지 않는다면 이러한 증상은 더욱 자주 일어난다. 일반적으로 1’C의 변화에 2%의 머무름 시간의 변동이 일어난다고 알려져 있다. 실험실 환경에 따라 이러한 문제는 항상 고려되어야 한다. 컬럼 오븐을 사용하는 것이 가장 좋은 해결법일 것이다.

머무름 시간 문제를 확인하기 위해서 아래와 같은 방법이 사용된다.

 

1.    Retention factor (capacity factor, k)

2.    Selectivity (α = k₂/k₁)

유량 변화가 발생 할경우 k에 해당하는 t0와 tr은 같이 변하기 때문에 k자체는 상수값으로 존재한다. 반면에 화학적 변화는 tr에만 영향을 미치기 때문에 k값은 변하게 된다. 보통 k값의 변화는 모든 피크에 적용되는 것은 아니다. 화학적 변화를 확인하기 위한 한 방법은 α 값을 확인하는 것이다. α 가 변한다면 화학적 변화가 발생한 가능성이 크다.

 

위 두가지 방법은 유량과 화학적 변화에 의한 머무름 시간의 변화 확인에 유용하게 사용할수 있다.

 

2.    과도한 머무름 시간 변화

K value는 일정하나 머무름 시간이 변할 경우 유량문제를 의심해 볼 수 있다. 두번째로 pump leak발생을 확인한다. 이것은 시스템 압력이 낮은 경우와도 연결된다. 시스템 압력이 높은 경우 에도 펌프 이상을 확인하여야 한다. Air bubble의 유입은 압력 변동(fluctuation)과 관련이 있다. 이러한 문제는 degassing실시 혹은 air purging실시로 해결한다.

문제가 계속될 경우 reservior의 frit이 펌프압에 저항하는지 확인한다. 체크밸브의 이상과 pump seal의 이상은 낮은 유량문제와 더불어 머무름 시간의 증가를 야기 한다. 체크 밸브를 풀어 sonication실시하는 방법이 문제 해결에 유용할 것이다. 대부분의 펌프에서 inlet check valve뒤의 drain hole에 발생하는 liquid dripping은 pump seal에서 발생하는 leaking과 관련이 있다. 과거 관리 기록을 살펴보아 교체한지 1년이상이 되었다면 교체하는게 바람직하다.

K value의 변화가 감지되었으면 머무름 시간의 증가가 시스템내 화학적 변화로부터 나온다는 증거이다. 이동상을 새로 제조하여 사용해 보자. 효과가 없다면 컬럼을 교체해 본다.

마지막으로 머무름 시간이 증가했을 경우 컬럼 온도가 낮아지지 않았는지 확인해 본다. 컬럼 오븐이 제대로 작동하고 있는지? 전원을 켜는 것을 잊지는 않았는지 확인한다.

 

3.    Retention is too small

머무름 시간이 예전보다 작아졌을 경우 method상의 실수가 있다고 해도 유량변화의 가능성은 거의 없다. 이의 원인은 leaking 혹은 기능 불량에 의한 유속 감소가 일어나는 경우는 있어도 기능 불량에 의한 유속과다로 인한 머무름 시간의 감소가 일어나진 않기 때문이다.

 

4.    Fluctuating Retention times

일반적으로 갑작스런 머무름 시간의 증감은 일어나지 않는다. 발생한다면 조작자에 의한 것으로서 이동상 조성의 문제 잘못된 컬럼의 설치 컬럼오븐 조정 실패에 기인한다. 24시간 이상 가동하거나 수천번의 인젝션에 의해 머무름 시간은 점차적으로 증가한다. 머무름 시간의 변동은 온도와도 연관이 있으니 특히 상온에서 분석하는 경우 주의가 필요하다.

 

컬럼에 무리가 갈 경우 점차적인 머무름 시간의 증가와 더불어 peak tailing이 발생한다. 만일 α값이 계산된 경우 Relative retention time의 변화가 종종 발생한다. 컬럼 문제가 의심될 경우 컬럼 교체를 시도해 보자.

 

단기적 머무름 시간의 변화는 이동상에 기인한다. 드물긴 하지만 헬륨sparging을 실시하면 이동상내의 휘발성 성분이 휘발되어 일어나기도 한다. 버퍼를 사용하는 경우 pH변화에 의해 머무름 시간의 변화가 일어나기도 한다. 일반적인 pKa에서 ±1의 범위를 벗어나는 경우가 이에 해당한다. LC/MS사용하는 경우 휘발성 이동상을 자주 사용하기 때문에 이동상의 수명도 고려해야 한다. 매일 새로 이동상을 조제하는 것이 맘편할 수도 있겠다. 버퍼를 사용하는 경우 유기용매를 섞기전에 pH를 측정하는 것을 게을리 하지 말자.

 

5.    Problem prevention

정기적인 기기점검과 유지능력이 요구된다. 컬럼온도는 머무름 시간에 큰 영향을 미치기 때문에 대다수의 컬럼오븐은 상온으로 온도를 유지하지 못한다. 최소 30~35’C의 범위로 설정한다. 설정된 온도로 승온하기까지는 보통 30분 이상이 소요됨을 감안하자. Solvent preheater를 오븐내에 사용하도록 하고 일반적으로 aluminium block내의 capillary tubing을 사용한다.

 

컬럼은 일반적으로 1000회 이상 주입에도 사용가능하나 전체 시료 분석에 사용되는 비용의 5%미만으로 시료당 분석 비용을 가늠한다. 컬럼 기능 유지를 위한 좋은 방법은 강한 용매로 flush를 시키는 것이고 이것으로도 컬럼을 재생하지 못할경우 교체한다. 가드 컬럼의 사용 및 적절한 시료 준비과정은 컬럼 수명을 늘이는 좋은 방법이다. 0.5um의 in-line filter의 사용은 autosampler와 컬럼 사이에서 column inlet frit을 막는 특정 물질을 막아주나 이런 것들이 머무름과 관련된 문제에 영향을 미치지는 않는다. 컬럼 수명을 유지하는 다른 방법은 한 가지 분석법에 하나의 컬럼을 사용하는 것이다. 수용성 이동상은 적어도 1주일에 한번은 교체하고 유기용매가 섞인경우 1달 내로 교체한다. (실제로는 1주일 내로 바꿔주는게 좋다… 자주 바꿔주자)

기타 참고 자료 첨부

1. 시료 혹은 첨가제의 성분에 의한 컬럼 충진제의 변성, 그에 따른 머무름 시간의 변화
- 시료 자체의 반복 주입으로 인한 컬럼 내 화학적 특성 변화

머무름 시간의 변화속도를 살펴 보면 오염원이 이동상에서 기인하는지 분석 시료에서 오는지 파악할수 있다.

TEST 1

1) 시료 반복 주입 (4번/시간)
2) 시료 주입 없이 같은 시간동안 이동상을 흘려준다.
3) 과정 1)을 반복
4) 머무름 시간에 대한 graph작성
- 시간에 대하여
- 주입회수에 대하여

시간에 대한 그래프가 부드러운 곡선을 나타내면 이동상이 원인이며
주입횟수에 대한 그래프가 부드러운 곡선을 나타낼 경우 시료가 원인임을 추측할수 있음.





Reference (아래 자료를 참고하여 본인 작성) 

1. Degradation of acetonitrile residues using oxidation processes (Regina C. da C. M. Micaroni; Maria Izabel M. S. Bueno^*; Wilson de F. Jardim)

2. Chromatography online "Troubleshooting basics part 3 : Retention problems"

3. http://ojszo.ipan.lublin.pl/a1_eng.html

4. 첨부 자료 ( Chromass )