Biochemical analysis

Biochemical samples

 

 

1.    Large bionolecules 일반적으로 3차원 구조를 가진다.

-       수용액에서 안정성을 보인다.

-       Small molecule의 경우 분리/분석에 있어서 구조적인 요인은 미미하다.

-       Native protein molecule은 3,4차 구조를 가지는게 일반적이다.

 

2.    Denaturation의 과정은 일반적으로 random coil(less folded) 이 되는 과정이다.

-       분리과정중 conformation의 변화가 발생할 수 있다.

 

3.    Primary structure

-       Biochemical macromolecule은 전형적으로 unit의 반복적인 형태이다.

-       Amino acid의 결합으로 이루어진 peptide, protein이나 oligonucleotide를 이루고 있는 nucleotide을 예로 들수 있다.

 

3.1.  Peptides & Proteins

-       -NH2, -COOH작용기를 가지는 amino acid가 amide linkage(-CONH)연결로 이루어진 중합체

-       일반적으로 5000Da 을 넘는 분자량을 가진다.

-       작용기의 특성에 따라 산성 염기성 중성으로 구분될 수 있다. 좀더 구체적으로 side-chain의 pK 값에 따라 구분된다.

-       이러한 성질은 acidic group과 basic group의 점유율에 따라 달라진다.

-       Proline 은 tran구조가 지배적이나 cis로 안정화되는 경향이 있다. RPC에서 분리 과정중 이러한 변화가 일어난다. 이러한 현상은 부분적 혹은 다수의 peak로 나타나기도 한다. 고온 환경하에서는 single band로 나타날수 있다.

-       Cysteine잔기는 disulfide bond의 reduction으로 위와 같은 현상이 나타날수 있다.

-       중성 pH환경에서 acidic peptide는 anion exchange column에서 Rt의 변화가 cation exchange보다 크다.

-       산성하 에서의 RPC에서 acidic peptide의 Rt변화는 basic peptide보다 크다.

-       RPC에서 산/염기 조건 적용 전후로 소수성 amino acid의 Rt변화가 크다. 이것은 hydrophobic 성질이 클수록 비례한다. (비극성 aromatic, aliphatic amino acid side chain이 Rt변화에 작용한다)

-       시료의 보관중에 variant의 발생 가능성이 있다. (deamination of asparagines or glutamine, oxidation of methionine, formation of cysteine disulfide bridges)

 

3.2  Oligonucleotides & Nucleic acids

- protein 및 peptide에 비해 denaturation의 영향이 적다.

- Intermolecular base pairing or aggregation 에 의한 다중 peak의 발생이 가능

- Formamide, urea, 고온(60도이상), high pH의 적용으로 위의 문제를 해결할수 있다.

 

4.    Requirements

4.1 Column

- 일반적으로 smaller, non-porous particles, lower flow rate요구됨

가. pore size

- 시료보다 큰(4배 이상) pore size가 필요, pore에 들어갈수 있어야 diffusion이 일어남.

-250~350Å 크기의 packing이 50 amino acid로 구성된 peptide, 25 residue의 oligonucleotides를 분리하는데 적당하다. 이것은 특히 분자량에 대한 정보가 없을 때 잘 쓰인다.

- 100,000 Da이상의 물질은 500~4000 Å 의 packing material을 사용하기도 한다.

-Saturation capacity(Ws)는 pore diameter, sample molecule size surface area로 이루어 진다. 최대 가능한 column capacity는 surface area에 비례하지만 sample이 pore를 충분히 통과하지 못하면 capacity는 감소한다.

-       Rt또한 capacity에 따라 변한다. K value는 surface area에 비례하기 때문이다. 따라서 작은 pore size -> surface area증가 -> k의 증가

나. Particle size

- Particle diameter는 column efficiency를 결정짓는 주요 요소 이다.

- 고분자에 대한 느린 확산은 wider band를 일으킨다. (1) non-porous particles of small diameter (2) flow-through or perfusive particle이 이러한 문제를 개선할 수 있다.

다. Column stability

- high pH (12이상), 고온 (50도 이상)의 조건은 bonded silica packing의 경우 bonded phase의 망실과 silica matrix가 녹는 현상을 일으킬수 있다. 이러한 이유로 bonded silica packing대신 sephadex agarose packing(carbohydrate-based packing)이나 polymeric packing(polysttrene, polymethacrylate)를 사용하기도 한다 하지만 column efficiency의 측면에서 bonded silica가 더 유리하다. 현재의 기술로 이러한 문제들은 개선이 되고 있다.

- Sol-gel silica support, endcapped alkyl bonded phase의 적용, 50mM이하의 유기 버퍼사용, 40도 미만 온도 적용이 pH 9이상의 조건에도 사용이 가능한 연구가 보고되고 있다.

 

4.2. Sample molecular conformation

- RPC보다 IEC HIC SEC이 protein의 native conformation을 유지하며 분리하는데 적합하다.(denaturation우려)

- denaturation이 전부 이루어 지지 않을 경우 부분적인 denaturation으로 인한 multiple band가 발생할수 있다. 고온으로 분석하는 경우 전부 denaturation이 되어 peak의 모양이 single narrow band형태가 관찰된다.

 

4.3. Sample recovery

- small molecule의 recovery는 실험오차를 감안하여 100%이다.

- large biomolecule은 partial denaturation 이나 irreversible attachment등으로 recovery가 달라지는 경우가 많은데 아래와 같이 개선할수 있다.

(1) 분석 시간 감소

(2) sample weight / column volume 의 비율 증가

(3) less active matrix사용 (agarose같은 친수성 material사용)

Small diameter column의 사용도 좋은 대안이 될수 있다.

 

4.4. Sample pretreatment

가. Sample solvent (RPC)

- 0.1~2mg/mL 의 농도

- 0.05~5% TFA in water의 초기 조건 비율이 일반적

- 6M guanidine-HCl or urea은 용해도 증가 대부분의 이동상과 용해 다수의 protein denaturation효과로 사용된다.

- 시료를 녹이는게 우선이며 유기용매의 사용이 불가피할 경우 미리 유기용매로 녹인뒤 물을 첨가 하는 방식으로 접근한다.

- 큰부피를 injection하는 경우 이동상과 sample solvent의 pH를 조정한다.

 

나. Surfactants

- RPC에서 SDS의 사용은 금지된다. 영구적인 컬럼 손상과 poor band shape 우려 때문

- Zwitterionic and neutral detergent(Triton X-100, X-114, Zwittergen, octylglucoside)은 SDS보다는 사용이 용이 하나 분석후 항상 column regeneration과정을 거쳐야 한다.

- IEC HIC SEC의 경우 surfactant의 사용이 가능하다.

다. Sample dissolution

- 만일 시료에 고분자 polypeptide나 protein이 있는 경우 vigorous shaking이나 mixing을 금한다.

(과도한 거품 발생 및 denaturation우려)

-       다 녹였다고 하여도 시간에 따라 침전이 발생하는 경우가 있으므로 관찰이 요구되며 원심분리나 filteration방식을 이용하는게 좋다.

라. Detection

- 잔기의 특성에 따라 흡광도의 변화가 발생한다.

(1) Purine & Pyrimidine bases (250-260nm) absorbance maxima

(2) Amide bond (210-225nm)

(3) Aromatic side chains : Phe, Tyr (254-260nm, less sensitive)

(4) Aromatic side chains : Trp, Tyr (270-290nm, less sensitive)

- Fluorescence detector의 경우 Tryptophan에 선택적으로 작용한다. (Excitation 280nm, Emission 350nm)

 

5.     Separations of peptide and protein samples

-       Resolving power의 장점으로 RPC는 peptide & protein의 분리에 이용되나 20,000Da이하의 분자에서는 refolding이 일어날 가능성이 있음에 유의 한다.

 

가.   RP-HPLC

-       Gradient elution이 자주 응용된다.

-       분리에 대한 주요 특징은 organic solvent modifier의 변화에 k가 매우 빠르게 변화

(0.1%B의 변화에 k 가 20% 변화하는 경우, 30,000Da protein)

- Method develop에서 (1) 최초 조건 선택 (2) retention 최적화 (3) 선택성 최적화 (4) column condition 선택

- 각 과정 중 관심있는 성분의 recovery를 확인한다.

 

나.   선호 조건 & 선택성 변화

-       Peptide의 basic amino acids때문에 packing은 low-metal non acdic silica가 선호된다.

-       Low pH 및 high temperature(40-80℃) 선호됨.

-       Protein분리의 경우 300Å의 C3~C8 or cyano ligand적용된 컬럼 선호

-       이동상 선택에서 low pH Acetonitrile buffer gradient 추천

(1)   넓은 범위의 물질 분리

(2)   Silanol의 이온화 억제(ion suppression)효과로 basic amino side chain의 silanol과의 불필요한 반응 억제

(3)   Denaturation 의 완결 보조 (partial denaturation 방지)

(4)   210nm이하 에서 검출 가능하게 하여 선택성 강화

(5)   Narrow peak 효과, 이동상 점도를 낮추기 때문임

(6)   TFA사용하는 경우 basic amino acid의 free amino 말단기와의 ion-pairing효과로 머무름이 미약하거나 나쁜 peptide의 머무름 시간 증가효과

-       인산은 200nm에서의 검출 감도를 증가시켜 TFA의 대체제로서 활용 가능하지만 TFA의 휘발성으로 분취할 경우 TFA가 더 선호됨

-       Propanol은 Acetonitrile의 대체가 가능하지만 점도가 높아 압력 문제 발생 가능.

-       0.12% TFA in water와 0.10% TFA in Acetonitrile은 gradient로 인한 baseline drift문제를 적게 만들수 있다.

-       Gradient condition에서 고려할 요소는 column dementions(dead volume), flow rate, sample molecular weight, gradient steppness(%B/min)

k* = 87  F/Vm 1/S 1/%B/min

F : Flow rate

Vm: Column size

S : Sample mol.wt

 

 

-       Sample molecular weight의 10배 증가는 %B가 3배 씩 줄여야 동일한 k를 얻을수 있다.

-       Run time이 동일할 때 Flow rate의 3배 감소는 Gradient steepness의 3배 감소와 효과가 동일하다.

-       TFA의 농도 및 컬럼 온도는 선택성에 큰 영향을 미친다.

-       Low pH이동상은 basic amino acid를 protonated시켜 각 basic group에 positive charge를 발생시킨다. 또한 컬럼 표면을 negative하게 만들어 결과적으로 머무름 시간을 증가시킨다.

-       Acidic peptide는 higher pH에서 머무름 시간이 증가한다. Carbonyl group의 protonation에 기인한다.

 

다.   일반적 문제와 해법

-역상컬럼 에서의 peptide 및 protein의 분리시 발생할수 있는 문제점은 아래와 같다.

1) wide, tailing or distorted bands

2) Low recovery

3) Ghosting

4) Multiple bands for a single compound

5) Column performance changes with time ; retention times not reproducible

 

1)     의 원인

-       적절하지 않은 컬럼의 사용, Acidic RPC column으로 peptide & Protein을 분리하는 경우 basic group으로 인한 silanol-interaction이 발생할 수 있다.

-       Non- acidic column의 사용을 권장한다.

-       친수성 및 pore diameter로도 발생할 수 있다. C18에 강하게 결합하는 protein은 짧은 chain의 소수성 bonded phase를 적용하여 해결한다. (C3, cyano)

-       Hydronamic diameter보다 약간 큰 pore size를 가진 경우 제한된 확산으로 인해 broadening이 발생할 수 있다.

1)~4) 의 결과는 denaturation에 의해서도 발생 가능하다. 분리 과정중 partial denaturation이 일어날수 있다.

Denaturation으로 인한 문제를 최소화 할 수 있는 방안은 아래와 같다.

1.     Low pH condition; 0.1% TFA이 선호된다. 소수성이 큰 protein은 10~25mM의 인산을 사용한다.

2.     Acetonitrile을 유기용매로 사용한다.; propanol은 소수성이 큰 protein의 경우 용이하다.

3.     컬럼 온도는 50~80℃

4.     전처리과정으로 6M urea나 guanidine hydrochloride를 사용한다. 상온에서만 가능

5.     chain수를 감안하여 소수성 bonded-phase packing 사용을 고려

6.     Zwitterionic detergent는 소수성 및 크가가 큰 protein의 분리에 첨가제로서 활용가능 하다. 다만 SDS은 peak shape 및 recovery의 문제를 야기 시킬수 있다.

-       Proline isomerization은 많은 peptide에서 관찰되는 현상이며 이로 인한 peak shape문제 (splitting, overlapping peak)발생 가능하다. 컬럼 온도 상승으로 개선 가능.

-       Polymeric packing and polymer-coated silica, alumina, zirconia column은 pH의 변화에 안정한 특징이 있지만 efficiency가 상대적으로 떨어져 분취용 이나 분리 초기에 활용가능하다. analytical사용시에는 alkyl-silica packing을 활용한다.

-       중간 및 높은 pH에서 안정적인 컬럼 사용은 낮은 온도에서의 분리, lower ionic strength mobile phase, organic or borate buffer를 사용한다.

 

6.    Ion-exchange HPLC

-       Protein의 분리에 있어서 bioactive form을 유지하면서 분리하기 위해서는 IEC의 적용이 유리하다.

-       Cation exchange에서 Mobile phase pH가 감소할수록 retention이 증가한다. 이것은 고정상의 negative charge증가로 인해 solute의 증가된 positive charge와 더 강하게 결합하기 때문이다.

-       Anion exchange은 위의 경우와 반대의 양상을 보인다.

-       pH가 등전점과 일치하는 경우 Retention은 양이온 교환 혹은 음이온 교환 chromatography중 하나에서 최소화 된다. 고분자 protein의 경우 일정 side에서 불균형 전하를 띠는 경우가 있어 이 경우 머무름이 증가하는 경우도 있다.

-       pH 3.0에서 –COOH group은 비이온화 된다. 반면에 basic residue 부분은 protonated되어 전체적으로 양전하를 띠게 된다. 따라서 대부분의 peptide 및 protein은 pH 3.0에서 양전하를 띠게 되어 cation exchange에서의 salt gradient조건에서 분리가 가능하다. Small peptide의 cation exchange분리시 처음에 pH 3.0조건이 추천되는 이유가 이것이다 하지만 denaturation의 가능성이 있기 때문에 실제 빈용되지는 않는다.

-       IEC를 이용한 peptide & protein의 분리는 단독 보다는 RPC와 병용으로 사용한다. IEC의 column capacity가 더 크기 때문이다. 따라서 최초 분리는IEC로 진행하고 이것을 바로 RPC로 연결하여 주입하는 방식이 일반적이다.

가.   분리 시작에 있어 선호되는 조건

-       AEC, CEC중 하나를 선택하고 안되는 경우 다른 방식을 선택한다.

1)     Salt

-       NaCl은 220nm같이 낮은 파장에서도 사용이 가능하지만 pH<5인 경우 매일 기기세척을 시행하여 부식을 방지해야 한다.

-       Sodium acetate는 부식의 우려는 없지만 230이상에서 검출 한계 및 감도 저하가 있다.

-       Sodium sulfate나 phosphate는 투명하고 부식성이 없다.

2)     Organic solvent

-       A or B solvent에 유기용매를 첨가할수 있다. 소수성 column packing을 사용하는 경우 시료의 응집현상이 일어나 peak broadening 및 distortion이 일어날 수 있다. 10%정도의 methanol 이나 Acetonitrile을 첨가하면 이런 문제를 해결할 수 있다.

-       유기용매의 비율이 높으면 활성 저하의 우려가 있으나 membrane-bound protein, histone 및 다른 재조합단백질은 70% 미만의 유기용매 비율에서 안정하다.

나.   Changing selectivity

-       IEC를 이용한 단백질의 분리, 분석에서는 RPC와 달리 gradient steepness 및 온도의 변화가 band spacing에 큰 영향을 미치진 않는다. pH가 더 중요 요인으로 작용한다.

다.   일반적인 문제점 및 해결

-       소수성 단백질과 polypeptide의 IEC분리에 있어 recovery가 문제 될 수 있다.

-       Gradient 진행 중 Salt의 농도가 높아지면 ion exchange retention이 감소하나 소수성 retention이 강해져 protein의 머무름은 처음에 감소하나 나중에 증가한다. (peak tailing 및 poor recovery) Hydrophilic IEC packing + 20% acetonitrile을 사용하여 개선 가능하다. 이것은 acetate 및 chloride를 사용하여 소수성 머무름 현상이 일어날 때도 적용가능하다.

 

 

Reference

1. http://schoolworkhelper.net/protein-structures-primary-secondary-tertiary-quaternary/

2. Practical HPLC method development 2nd edition (Lloyd et al.)