GC-MS derivatization

[ 개요 ]

MS 가 상용화되면서 LC/MS 나 GC/MS 가 각광받기 시작하였다. MS 는 기존의검출기에 비해 sensitivity 와 selectivity 가 뛰어난 검출기로 알려져 있다.LC/MS 와 GC/MS 는 그 이동상에서 차이를 보이는데 LC 는 liquid 를 GC 는gas 를 사용한다는 점인데 LC/MS 는 이동상이 액체이기 때문에 오염가능성이높고 GC 에 비해 그 이동상의 선택에 많은 제한이 따른다.

GC/MS analysis에서는 유도체화를 많이 이용하는데, 유도체화를 시킬 경우 비휘발성 물질은 휘발성 물질로 전환이 가능하고 GC chormatogram상 분리능의 향상을 가져오고 MS에서 특정 이온을 생성시킴으로서 화합물의 정성분석이 아주 용이하며 그 감도도 매우 우수하다. 유도체화에는 methylation [10], silyl derivatization [10, 12], acetylation [11], esterification 등 여러 가지가있다. methylation, acetylation 유도체의 경우 상당히 안정하지만 그 유도체시약의 독성이 강하고 분자구조 내에서 원하지 않은 부위의 변화를 가져올 수 있는단점을 가지고 있다. silyl 유도체나 esterification 유도체의 경우에는 시약의독성은 적은 편이지만 그 유도체 자체가 시간이 지나면 공기중의 수분에 의한유도체의 불안전이 단점으로 알려져 있다.

유도체화에 유용한 정보를 담고 있는 두가지 책을 소개하면, (1) Handbooks of Analytical Derivatization Reactions by Daniel R. Knapp (2) Silylation of Organic Compounds by Alan E. Pierce 이다.

유도체화의목적

적합성

종종 compound는 특정방법으로 분석할수 없는 경우가 생긴다. 분석가능한 "형태"가 아니기 때문이다. 예를 들면, GC상에서 비휘발성 물질의 분석 내지는 LC상에서 잘 녹지않는 물질의 분석이 여기에 해당한다. 특정 조건에서 불안정한 물질도 마찬가지이다. 유도체화의 목적은 화학 구조를 적절히 조절해줌으로서 기술적으로 요구되는 조건에서 분석을 가능하게 하는데 그 목적이 있다.

효율성

compound와 그 mixture의 직접 분석은 쉽지않은 과정이다. compound 사이, 컬럼과 compound사이의 상호 작용때문인데, 이러한 요인들은 poor peak resolution 내지는 비대칭적인 peak모양을 나타낸다. 따라서 peak identification과 impractical 한 결과를 가져오게 된다. 

많은 경우에 유도체화된 물질로 전환되면 위와 같은 상호 작용을 줄이는 장점이 있다. 이를테면, co-elute되는 경우나 poor resolved되는 경우 둘중 하나혹은 둘다 전환됨으로 인해 적절히 분리가 이루어지는 것이다.

검출성

소량의 물질을 분석하는 경우에 검출기의 범위를 늘이는 방법을 생각할수 있다. 검출기의 디자인을 향상시키는 ( 특정 원소나 작용기를 목표로 한..) 방법등을 이용함으로서 감도를 높일수 있다.  흔히 쓰이는 다른 방법으로는 유도체화를 통하여 compound자체의 감도를 높이는 방법이다. 이것은 유도체화로 compound의 크기를 증가시키는 과정이다. (원소나 작용기의 증가로서 검출기와의 상호 작용을 높인다. )  GC에서의 적용에서 할로겐 원소를 붙여 electron capture detector(ECD detector)의 감도를 높이거나 TMS 유도체화를 통하여 mass ion의 직접적인 분절을 관찰할수 있다. 

유도체화의 종류

GC의 경우 크게 3가지의 일반적인 반응이 사용된다. (1) Alkylation (2) Acylation (3) Silyation 이 그것이다. active hydrogen을 가지고 있는 작용기 ( - COOH , -OH, -NH, -SH )가 존재하는 compound의 경우 이러한 유도체화를 우선적으로 고려할수 있다. 이러한 작용기는 분자간 수소결합을 이루는 경향을 가지고 있으며 이러한 작용기를 가지고 있는 compound의 휘발성에 영향을 미친다. 그외에 column packing material과의 좋지 않은 작용을 일으키는 성질, 열적 안정성에도 영향을 미친다. alkylation, acylation, silyation 모두 이런 성질을 가지고 있는 compound에 적용하고 있다.

[1] Silyation ( Silyl : silyl group is H3Si–. )

silyation은 일반적으로 trimethyl-silyation [ Si(CH3)3 ] 의 약어로 사용한다. 마찬가지로 dimethylsilyl [ SiH(CH3)2 ], t-butyldimethylsilyl [ Si(CH3)2C(CH3)3 ] 그리고 chloromathyldimethylsilyl [ SiCH2Cl(CH3)2 ]같은 다른 silyl그룹을 붙이는 것을 지칭한다. 

Silyl 유도체화는 GC에 있어서 가장 널리 쓰이고 있는 방법이다. acid, alcohol, thiol, amine, amide, enolizable ketone, aldehyde에 존재하는 active hydrogen을 trimethylsilyl group과 교환된 형태로 바꿔준다. 다양한 시약들이 이러한 반응을 유도하게끔 사용되고 있다. 차이점은 각각의 반응성,선택성 그리고 부반응과 반응에 의한 부산물의 특징등이다. 
silylation 시액과 TMS 유도체 모두 물에 대해 불안정하기 때문에 반드시 습기 접촉을 최소화 해야 한다. 바이알에 존재하는 습기나 수용액으로 washing과정중 혼입되는 경우가 존재하기 때문에 주의를 요한다. t-butyldimethylsilyl의 경우 trimethylsilyl보다 가수분해에 더 안정하다고 알려져 있다. 이 시약은 또한 특유의 질량 분절 패턴을 보여주기 때문에 GC/MS 실험에 유용하다. 위 두개의 시약은 열에 대한 안정성을 가지고 있어 넓은 범위의 주입 온도와 컬럼 조건에 사용할수 있다.

silylation reagent는 대부분의 active hydrogen을 유도체화 시킬수 있기 때문에 컬럼 고정상이 이러한 작용기를 가지고 있는 경우 주입하면 안된다. 예를 들면 silyating reagent와 친화성이 없는 packing인 CARBOWAX(polyethylene glycol), FFAP ( free fatty acid phase )가 여기에 해당한다.

습기의 영향

물은 TMS 시약과 그 유도체 모두를 가수분해 시킨다. silylation reagent는 (본 thread는 pierce사의 시약을 예로들고 있다. ) Hypo-vial storage내에 질소로 충진된 상태에서 봉해져 있거나 1mL ampule로 판매하고 있다.
 시약을 취할시에는 (피하)주사기를 이용하여 빼내고 이로인한 압력의 변화는 비슷한 용적의 질소를 넣어줌으로서 보충할수 있다. 최적화된 결과는 개개의 유도체, 혹은 동시에 유도체 그룹에 대하여 ampule을 사용하는 것으로서 얻을수 있다. 개봉한 ampule을 dry nitrogen으로 채워진 용기내  혹은 시약을 조심스럽게 오븐에

Hexadimethylsiloxane

건조시킨 용기에 위치시켜 여러번 사용할수 있다. 만일 건조한 바늘,주사기, 기타 장비를 사용한다면 이러한 처리가 요구되거나 습도가 높은 실험실이 아닌경우 반드시 dry box technique가 필요하지는 않다. 많은 경우에 있어 silylation reagent는 많은 양을 필요로 한다. 따라서 샘플내 존재하는 매우 작은 양의 습기는 물이 시약과 반응하여 화학적으로 system에서 제거되기 때문에 용인될수 있다. TMS유도체와 시약의 가수분해는 hexamathyldisiloxane [ (CH3)3SiOSi(CH3) ] 을 만든다. 적은 양의 siloxane은 시약내에 존재할수 있으며 불활성물질이며 부반응으로 인한 부산물의 생성내지는 반응에 대한 방해물로 작용하지 않는다. 그 이유는 매우 휘발성이 높으며 chromatogram상에서 solvent 또는 reagent에 의해 용리되기 쉽기때문이다.

반응시간

반응시간은 compound에 따라 천차만별이다. 상온에서 몇 분 혹은 수초 내에 반응이 완결되기도 하지만 어떤 것들은 승온상에서 상대적으로 반응 시간을 요구하기도 한다. 간단한1차 알콜은 보통 상온에서 5분 이내로 완전히 유도체화된다. 반면에 다른 물질은 촉매 존재하에 150’C 만큼 높은 온도에서 장시간을 요구하기도 한다. 일반적으로 silylation의 잘되는 순서는 1,2,3차 alcohol, phenol, carboxylic acids, amines(1,2차순), amide이다. 3차 아민은 시약과 반응하지 않는다. 반응성이 확인되지 않은 물질을 유도체화 시킬때는 주기적으로 반응액에 대한 GC분석을 수행하여 모니터링하는게 좋다. 시작물질의 피크와 반응물의 피크의 증감을 통해 반응의 정도를 알수 있을 것이다.

 

열 안정성

TMS유도체의 장점중 하나는 열에 대해 안정하다는 것이다. GC 에서는  300’C의 주입구와 컬럼 온도에 주로 사용된지만 350’C혹은 그 이상의 온도에서도 사용할수 있다. TMS시약은 그 자체로 열에 대해 안정하다. 그러나 silyl donor로서더 반응성이 있는 BSTFA, BSA는 승온 상에서 분해된다. 시약의 순도를 측정하기위해 GC를 이용할 경우 주입구 온도는 125-150;C glass lined injection port가 필요하다. 이러한 시약들을 사용하여 유도체화 과정을 시킬경우 온도는 75’C이상으로 유지하도록 주의를  기울인다. 이 온도에서 시약의 분해가 매우 잘 일어나기 때문이다.

 

가수분해 안정성

 

TMS유도체가 열에 대해 상당히 안정된 형태이지만 가수분해에 대한 안정성은 매우 변화가 크고 사실, 쉽게 가수분해가 된다고 봐야한다. 당의 TMS유도체는 물에대해 상당히 안정적인 머무름 시간을 보여주는 반면,  그러나 아미노산의 TMS유도체는 즉시 가수분해가 이루어진다. 다른 물질의 가수분해 정도는 두 극단의 사이에 존재한다. 일반적인 가수분해에 대한 안정성의 순서는 alcohol, phenol, carboxylic acid, amine, amide이다 그러나 구조나 공간 배치에 대한 결과로서 이러한 그룹 사이에서 다양한 변화가 일어난다. 특정 TMS유도체의 안정성에 대한 적절한 정보가 부재한 경우에 주의깊게 보관을 해야 하겠다.  많은 silylated sample을 보관할 때 가장 좋은 방법중 하나는 과량의 silylating 시약과 함께 보관하는 것이다.

 

용매 제안

Silylation 시약이 active hydrogen원소와 반응하기 때문에 특정 그룹(alcohol, acids, primary and secondary amines, mercaptans, primary and enolizable ketones)을 가지는 모든 용매는 사용을 피해야 한다. 종종 과량의 silylation 시약은 그 자체로 용매로서 거동한다. 따라서 분석계획에 있어 추가로 넣어주는 수고를 덜 수 있다. 몇몇의 경우에  반응전 compound가 잘 녹지 않아도silylated product 는 시약에 잘 녹을수 있다. Hexane, ether, benzene, toluene같은 비극성 유기용매는 반응물에 대한 좋은 용매로 쓰인다. 그러나 이런 용매는 반응 속도 자체에 영향을 미치지는 못한다. 더 극성인 용매들, pyridine, dimethylformamide(DMF), dimethylsufoxide(DMSO), tetrahydrofuran(THF)와  Acetonitrile는 반응속도를 증가시키는 경향을 보여 더 자주 쓰인다. TMS반응의 경우 pyridine은 organochlorosilane을 사용하는 반응에서 HCl acceptor로 작용하여 매우 좋은 용매로서 작용한다. 몇가지 경우에 있어Silylation 촉매로서 pyridine을 고려할 수 있지만 다른  용매에 비해 pyridine이 반응속도를 오히려 낮추는 예도 많이 보고되어 있다. 뿐만 아니라 pyridine은 이차반응물을 생성하거나 chromatography상에서 예상치 못한 효과를 보이기도 한다. DMF는 steroid와 다른 큰 분자에 쓰이는 용매이다. DMSO는 3차 알코올 내지는 다른 silylation 용매에서 제한적인 용해도를 보이는 물질의 TMS유도체화의 준비과정에 용이하다. 많은 silylating 용매가 DMSO에 불용성을 보이지만 반응은 때로는 성공적으로 이루어지기도 한다. 반응물이 잘 뒤섞이거나 dioxane같은 co-solvent를 이용하여 섞어주는 경우를 예로 들 수 있다.  문헌 조사를 통해 비슷한 물질의 반응에 대해 주의깊게 알아볼 필요가 있다.

 

컬럼의 선택

앞에서 언급했지만,Silylating 시약과 TMS유도체모두 active hydrogen에 반응하기 때문에 이러한 작용기를 가지는 모든 고정상의 사용을 피해야 한다. 이것은 만족스럽지 않은 결과를 얻을 뿐더러 컬럼에 심각한 손상을 미치거나 컬럼의 성질을 바꿔버릴수 있다. Polyethylene glycol ( CARBOWAX, polyethylene glycol )이나 FFAP ( free fatty acid phase )로 packing된 컬럼은 적합하지 않다.  TMS유도체에 대해 가장 적합한 컬럼은 silicone계열 컬럼이다. 비활성과 안전성을 동시에 갖추고 있으며 TMS유도체에 대한 뛰어난 분리능을 보여준다. 고유의 열 안정성과 TMS유도체의 열안정성의 조합은 GC분석에 있어 다양한 활용을 기대하게 한다. 이 계열 컬럼의 큰 장점중 하나는 넓은 극성 범위에서 적용이 가능하다는 것이다. SEA-30, OVA-1, OVA-101 고정상과 같은 비극성 메틸 실리콘재질은 컬럼 선택에 있어 처음 고려되는 type이다. 좀더 극성의 환경이 요구될 경우에 OV-17, OV-25같은 phenyl methyl silicone이 고려대상이 될 수 있다. 극성이 높은 phase는 Silar 9CP( Cyanopropylmethyl silicone ), OVA-225 ( Cyanopropylphenylmethyl silicone )이 유용하게 이용될 수 있다.

 

Glass injector port

Silylating 시약의 운용에 있어 glass injector port 나 direct-on column injection into glass column 이 사용된다. Stainless steel injection port를 사용하는 경우에 재현성이 없고 엉뚱한 결과가 빈번히 발생한다. 몇 주 간의 사용간에 확실히 나타난다고 할 수는 없지만 한번 나타나면 injector의 교환이 정답이 될수 있다. Glass liner의 삽입을 통하여 이러한 문제를 해결하는 경우가 보고되었다. 하지만 문제의 해결과정이전에 무작정 glass liner를 사용하는 것은 신중한 절차가 요구된다.

 

Column conditioning

 

TMS유도체를 사용하는 column은 사용전에 반드시 컨디셔닝을 시켜준다. 안정된 베이스라인이 잡힌 상태에서 유도체를 주입시킨다. HMDS(HMDS is a Silylation Reagent for GC Derivatization that is a weak TMS donor, used for silylation of carbohydrates and is used as a mixture with pyridine and trifluoroacetic acid) 가 이런 목적을 위해 사용할수 있다. Silyl-8 column conditioner(product #38015)는 packed column에 추천된다. 컨디셔닝이 완결될때까지 10-50 pl의 sample을 2~3분 간격으로 주입한다.  컬럼은 150-200’C를 유지한다.( 185’C가 이상적이다) 마지막 주입이 끝난뒤, 컬럼온도를 5-10분동안 승온시킨다. 그 후에 TMS시약은 컬럼 컨디션을 유지시킬 것이다. 만일 컬럼이 비활성 이거나 비TMS sample을 사용하는 경우에 silylated 될 수 있는 비휘발성 잔사를 없에기 위해 이러한 처리를 반복할 필요가 있다.

Column materials

Silylated glass column이 TMS유도체와 시약의 운용에 있어 이상적인 표면을 제공하지만 glass를 고집할 필요는 없다. Stainless steel재질 컬럼은 널리 사용되어 만족할만한 결과를 낼수 있다. 앞서 말한 문제점들은 액체에서 기체로 전환되는 과정에서 stainless와 접촉하여 생기는 부식에 의한 것으로서 일단 가스형태로 바뀌게 되면 TMS유도체는 stainless steel column내에서 상당히 안정적으로 존재한다. 경험상, 금속과 그 이온은 TMS시약과 그 유도체의 분해를 촉매한다고 알려져 있다. 따라서 유도체의 분해에 따르는 문제점을 분석할 때 금속에 의한 오염을 고려할 필요가 있다.

 

Application

[1] Sugar analysis  (determination of the absolute configuration of sugars )

Chem. Pharm. Bull. 56(2) 203-206 (2008) Jung et al.

The dried sugar mixture was dissolved in pyridine (0.1ml), and then the solution was added to a pyridine solution (0.1ml) of L-cysteine methyl ester hydrochloride (2mg) and warmed at 60'C for 1h. The solvent was evaporated under a N2 stream and dried in vacuo. The residue was trimethylsilylated with TMS-HT (0.1ml) at 60'C for 30min. After the addition of hexane and water, the hexane layer was removed and checked with GC. The retention times(tr) of the peaks were 23.73 min (L-Rha) and 37.87 min (D-Glc). The tr of the peaks of the authentic samples were 37.87 min (D-Glc), 39.90 and 40.65 min (L-Glc), and 23.73 min (L-Rha),respectively.




The structure of thesemetabolites, especially hydroxy polyunsaturated fatty acids, is typically determined by gas chromatography/electron impact (GC/EI) mass spectrometry after multistep
derivatization procedures including methylation,hydrogenation and trimethylsilylation. Considerable
sample loss occurs during the lengthy derivatizationprocedure ; therefore, sensitive structural analysis isoften hampered. It has been reported that fragments generated by negative ion tandem mass spectrometry (MS/MS) are useful for structural analysis of epoxy-fatty acids.

The introduction of solid-state ion sources, such as fast atom bombardment (FAB) and liquid-phase ion sources, such as ESI or atmospheric pressure chemical ionization (APCI) allowed the direct lipid analysis (Griffiths, 2003).

Hermansson et al. (2005) developed a fully automated method for the analysis of the lipidome using LC-ESI-MS that delivers quantitative data for more than 100 polar lipids, originating primarily from phospholipids.

The so-called shotgun lipidomics approach uses crude tissue extracts, commonly obtained by Folch or Bligh-Dyer extraction methods. It is based on direct sample injection of the extract, using both positive and negative mode ESI (Han&Gross,2003, 2005).

ESI in positive mode allows the detection of acylcarnitines, phosphatidylcholine,
lysophosphatidylcholine, phosphatidyl ethanolamine, and sphingomyelins. Free fatty acids, phosphatidic acid, phosphatidyl serine, phosphatidyl inositol,phosphatidyl glycerol, and phosphotidylethanolamine are ionized by negative mode ESI.

Neutral lipids, such as triacylglycerols are not readily ionized by ESI, however they can be detected as
ammonium, lithium, or sodium adducts with ESI in positive mode(Duffin, Henion,&Shieh, 1991; Hsu&Turk, 1999; Han&Gross,2005).

MS/MS experiments are used to further identify lipid species or to screen for individual lipid classes. For example,phospholipids with specific head groups show characteristicfragmentation patterns in CID spectra that can be used for theiridentification (Griffiths et al., 2001; Pulfer & Murphy, 2003). A
similar approach using characteristic CID fragmentation has been
developed for sphingolipid analysis or sphingolipidomics (Merrill
et al., 2005).

Specifically, neutral-loss scans and precursor-ion scans can be used to identify lipids in samples and to determine the molecular masses of the compounds.



ref. ( 아래 참고 문헌을 해석,정리함 )

1.Simultaneous determination of free fatty acids using tert-butyldimethylsilyl derivatization by GC-EI/MS/SIM

2. Structural Analysis of Hydroxy Fatty Acids byThermospray Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry  H. Y. Kim? and S. Sawazaki

3. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mas.20108/pdf

4. Pierce 2003-2004 Applications Handbook & Catalog

5. http://www.labplus.co.kr/tech/uploadHTML/regis.pdf

regis.pdf

6. http://www.google.co.kr/imglanding?q=GC%20derivatization&imgurl=http://x-linkbioscience.com/Structure.Gif&imgrefurl=http://x-linkbioscience.com/x-linkprotomain.html&usg=__WP1Pkl-D36PlY-vW4BKVpqsyjto=&h=326&w=350&sz=27&hl=ko&zoom=1&um=1&itbs=1&tbnid=ZY7xJER4mDpJ6M:&tbnh=112&tbnw=120&prev=/images%3Fq%3DGC%2Bderivatization%26um%3D1%26hl%3Dko%26newwindow%3D1%26sa%3DN%26tbs%3Disch:1&um=1&newwindow=1&sa=N&tbs=isch:1&start=0#tbnid=ZY7xJER4mDpJ6M&start=1

GC-MS (GC) fatty acid analysis conditions

1. GC Analysis of Fatty Acid Ethyl Esters
A Shimadzu GC-7AG gas chromatography equipped with a flame
ionization detector (FID) was used for GC analysis of fatty acid ethyl esters.
GC separations were performed on a Bpl capillary column (50 m X 0.22 mm
ID) (SEG Company). The temperature was programmed from 150°C to 280°C
at the rate of 3"C/min increment, while the temperature at the injector and the
detector was kept constant at 280°C. The carrier gas was nitrogen.
[ http://pdfserve.informaworld.com/538792_758494928_747272114.pdf ]


2.GC and combined GC-MS analysis. The GC analysis of
fatty acid methyl esters was carried out by using a Hewlett-
Packard model 5890A gas chromatograph equipped with a
30-m type DB-1 fused silica column (J & W Scientific) and a
flame ionization detector. The following temperature program
was used: 100°C for 2 min, followed by an increase of
3"C/min until a temperature of 300°C was reached and then
holding for 10 min. The GC-MS analysis was performed by
using a Hewlett-Packard model 5985 GC-MS system with an
ionizing energy of 70 eV and a type DB-1 fused silica column
(15 m; J & W Scientific). The following temperature program
was used for the GC-MS analysis: 80°C for 2 min, followed
by an increase of 30"C/min until a temperature of 180°C was
reached, an increase of 10"C/min until a temperature of
300°C was reached, and a 15-min hold. Both the GC analysis
and the GC-MS analysis

http://ijs.sgmjournals.org/cgi/reprint/41/2/213.pdf

GC-MS conditions
The GC-MS system consisted of a Shimadzu
GC-17A chromatograph, a Shimadzu QP5050A
mass spectrometer and a Class-5000 data system.
Compounds were separated on a 30 m × 0.25 mm
i.d. DB-1 capillary column coated with a 0.25 μm
film of dimethyl polysiloxane. The temperature of
the non-polar column was 150 ºC after injection then
programmed at 5 ºC·min-1 to 250 ºC, and maintained
at that temperature for 5 min. Split injection was
conducted with a split ratio of 10:1, the flow-rate
was, 1.0 mL·min-1, helium was used as the carrier
gas and the injector temperature was 250 ºC. The
MS detection conditions were as follows: interface
temperature, 230 ºC; ionization mode, EI+; electron
energy, 70 eV; full scan acquisition mode; mass range,
33-450 amu. Compounds were identified by using
online NIST-library spectra and published MS data.

Methylation of fatty acids
Fatty acid samples (100 mg) were dissolved in 5
mL 0.5 % (w/v) sodium hydroxide in methanol in a 25
mL flask with a ground-glass stopper and boiled under
reflux for 45 min. Then, 2.0 mL boron trifluoride-ether
solution was added and the solution boiled for 5 min.
After this, 5 mL hexane was added and the solution
boiled for 5 min. The solution was cooled, then a
quantity of saturated sodium chloride was added and
shaken for about 10 s. After this, 1.0 mL of the upper
phase was collected and 0.5 mL eicosane solution
was diluted to 5 mL with hexane to provide a sample
solution.

http://www.asianjtm.com/qikan/manage/wenzhang/AJTM07-2(3)-7.pdf



 GC and combined GC-MS analysis. The GC analysis of
fatty acid methyl esters was carried out by using a Hewlett-
Packard model 5890A gas chromatograph equipped with a
30-m type DB-1 fused silica column (J & W Scientific) and a
flame ionization detector. The following temperature program
was used: 100°C for 2 min, followed by an increase of
3"C/min until a temperature of 300°C was reached and then
holding for 10 min. The GC-MS analysis was performed by
using a Hewlett-Packard model 5985 GC-MS system with an
ionizing energy of 70 eV and a type DB-1 fused silica column
(15 m; J & W Scientific). The following temperature program
was used for the GC-MS analysis: 80°C for 2 min, followed
by an increase of 30"C/min until a temperature of 180°C was
reached, an increase of 10"C/min until a temperature of
300°C was reached, and a 15-min hold. Both the GC analysis
and the GC-MS analysis were carried by using helium as the
carrier gas.

Distribution and Phylogenetic Significance of 27-Hydroxy-Octacosanoic Acid in Lipopolysaccharides from Bacteria: Belonging to the Alpha-2 Subgroup of …