Mass spectrometry introduction (GC/MS)

GC/MS (EI 위주로…)

1.       검출기 선택시 고려 사항

가.   Selectivity : 분석 대상 화합물에 적합한지?

나.   Sensitivity : 분석 대상 화합물에 적합한 감도 (S/N ratio, MDL)

다.   Linearity : 정량을 위한 검량선 작성시 직선성이 충분한가? (Linear range, overload)

-      직선성 = 최대검출농도 / 최소검출농도

*** MDL

방법검출한계(MDL, method detection limit)란 시료와 비슷한 매질 중에서 시험분석 대상을 검출할 수 있는 최소한의 농도로서, 제시된 정량한계 부근의 농도를 포함하도록 준비한 n 개의 시료를 반복 측정하여 얻은 결과의 표준편차(s)에 99 % 신뢰도에서의 t-분포값을 곱한 것이다. 산출된 방법검출한계는 제시한정량한계값 이하이어야 한다.

 

방법검출한계 = t(n-1, α=0.01) × s

여기서 t(n-1, α=0.01)는 아래의 표에서 구한다.

자유도 (n-1)	2	3	4	5	6	7	8	9
t-분포값	6.96	4.54	3.75	3.36	3.14	3.00	2.90	2.82

 

 

관련 용어 정의 및 개념

A. Blank: 측정하고자 하는 물질 성분이 포함되어 있지 않은 상태. 이러한 경우에도 물질 성분의 존재 여부와 무관하게 잡음(Noise)이 존재하므로 측정신호는 완전히 Zero 가 아니며, 확률적으로 정규분포를 따르며 평균(Mean)과 표준편차(Standard Deviation)로 나타냄

B. Detection Limit(DL) 또는 Limit of Detection(LOD): 확률적으로 규정된 신뢰도(Confidence Factor, 통상적으로 99% 신뢰도) 기준으로 ‘Blank’와 구분할 수 있는 최소한의 물질량으로 ‘Blank’ 표준편차의 3배로 정의됨. 정량적으로 정확하게 측정할 수는 없지만 존재 여부는 판단할 수 있는 기준을 제공함

  i. Instrument Detection Limit(IDL): 측정장치가 해당 물질의 존재를 감지(Detect)할 수 있는 최소 물질량 한계치로 샘플(Sample) 준비과정에서 나타날 수 있는 오차를 고려하지 않음.

 ii.  Method Detection Limit(MDL): IDL과 유사하나 샘플 준비과정과 실험 담당자의 능력 등을 고려하여 해당 물질의 존재를 감지할 수 있는 최소 물질량 한계치

C. Limit of Quantitation(LOQ): 해당 물질 성분을 정량적으로 정확하게 측정할 수 있는 최소한의 물질량 한계치. 통상적으로 99.9% 신뢰도로 ‘Blank’ 표준편차의 10배로 정의됨

D.  오류(Error): 확률적으로 아래와 같은 2종류의 Error를 고려함

 i. Type I(알파 또는 False Positive) Error: 실제로는 특정 물질이 전혀 포함되어 있지 않은 경우(Blank), 측정신호가 LOD 보다 크게 나와 마치 해당 물질이 존재하는 것으로 잘못 판단할 수 있는 오류. 이러한 확률은 Blank 정규분포 곡선을 기준으로 따라 대략 1% 정도로 낮음

 ii. Type II(베타, 또는 False Negative) Error: 실제로는 특정 물질량이 LOD 만큼 포함되어 있는 경우, 측정신호가 LOD 보다 낮게 나와 마치 해당 물질이 존재하지 않은 것으로 잘못 판단할 수 있는 오류. 이러한 확률은 LOD 정규분포 곡선을 기준으로 보면 50% 정도로 큰 편임.

E.  Not Detected(ND): 특정 물질량이 LOD 보다 낮은 값으로 존재할 수 있다는 것을 의미함

 

2.  검출기 선택 (GC/MS)

-       GC/MS에 쓰이는 검출기는 다양한 종류가 있으나 FID의 경우 넓은 감도 범위를 지니고 있어 직선성이 뛰어나다고 할수 있다. ECD와 MS(SIM mode)의 경우 뛰어난 감도를 지니고 있음.

 

 

3.   MS는 3차원의 데이터 처리 개념을 지닌다. 시간과 intensity의 2차원에 Mass 의 정보를 포함한 것이다.
 

4.   GC/MS system

간단한 Mass spectrometer의 모식도이다 GC에서 시작된 분리된 analyte는 tranferline을 통해 Ion source로 들어가게 된다. MS system내에서는 진공이 유지가 되는데 진공이 필요한 이유는…

1)       평균 자유 행로 증가

2)       MS hardware보호(필라멘트,이온원,사중극자 등… 고에너지 반응을 통한 2차 산물 발생이 가능)

***평균 자유행로 :

기체 분자가 다른 기체 분자와 충돌하지 않고 비행할 수 있는 평균거리 이온화함 속의 압력이 10^-5torr일 때 기체 분자의 평균 자유 행로(MFP)는 10⁴cm가 된다. 이온의 평균 자유 행로는 이보다 작지만 이온화함의 크기(∼1 cm)보다는 훨씬 크다. 따라서 전자 이온화에 의해 생성되어 출구 슬릿을 빠져 나오는 다른 중성 분자와의 충돌을 거의 경험하지 않는다.
그러나 이온화함의 압력이 10^-5torr보다 훨씬 커지면 이온과 중성 분자간 화학 반응의 수율도 높아지게 되며 이렇게 생성된 이온들도 질량스펙트럼에 나타나게 된다. 그러므로 전자 이온화함은 누출 전도도를 크게 하여 쉽게 펌프 되도록 설계되어 있다.

 

이러한 진공유지를 위해 기기내에 high vacuum pump가 설치되어 있으며 이를 보조하는 backing pump가 외부에 노출되어 있다. MS부분에서는 transferline부터 진공이 걸린다. Transferline의 최대 허용 온도는 350℃ 정도 이다.

내부 turbomolecular pump는 10^-4 에서 10^-12 Torr의 압력 능을 지니며 backing pump는 10^-4 Torr정도의 능력을 지닌다. Turbomolecular pump는 추가적인 유지보수가 필요하지 않으며 문제발생시 통체로 교체한다.

실제 사용시 기기를 작동한뒤 3~4시간은 진공이 충분히 걸리도록 준비 시간을 갖추는게 중요하다.

 

 

실제 Mass detector내부에서는 필라멘트에서 방출된 고에너지가 analyte molesule에 충돌하여 M+이온을 만드는 과정으로 시작된다. repeller에는 양전하가 걸려있기 때문에 충돌되어 생성된 M+이온은 전진과정을 시작하게 되며 미처 양이온화 되지 못한 중성분자 혹은 음이온들은 collector로 들어가 제거 된다. Lense에는 약한 음전압(Extraction lens : typically -7V, Collonating lens : -50~-120V)이 걸려있어 전진하는 양이온에 대한 focusing과정(위치 조정 및 가속)을 한다. Pre-Quads에서는 pre-filter역할을 수행한다. 중성 및 음이온을 다시 걸러준뒤 양이온은 quadrupole로 들어가게 된다.  사실 quadrupole은 다양한 mass analyzer중 하나로 그 외 종류는 아래와 같다.

• Magnetic (B) and/or Electrostatic (E) (HISTORIC/OLDEST)

- High resolution
- High sensitivity (소숫점 이하 4자리 유효)
- High cost/huge

• Time-of-flight (TOF)

- High speed (100~1000 spectra/sec)
- High sensitivity
- Wide mass range
- High cost
- New technology for GC/MS (Relatively)
- 재현성이 상대적으로 떨어짐?

• Quadrupole (Q)

- Rapid screening
- Easily interfaced
- High sensitivity
- GC와의 결합에 장점이 많음 ( best GC detector ever made...?)

• Quadrupole Ion Trap (IT)

• Linear Ion Trap (LT)

- Ion trap type은 저렴하나 matrix에 따라 결과 변동이 있고 거의 쓰이지 않음

• Orbitrap

• Fourier Transform-Ion Cyclotron Resonance (ICR)

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Ø  Quadrupole analyzer

4개의 molybdenum 막대로 이루어져 있으며, 한쌍(1,2)은 dc voltage가 또다른 한쌍(3,4)은 radio frequency voltage가 가해진다.Dc voltage가 0이고 RF voltage(rate of oscillation in the range of about 3 kHz to 300 GHz, which corresponds to the frequency of radio wave)만 있으면 모든 이온이 통과할 수 있다  가해지는 전압의 진폭은 선택된 m/z의 비에 해당되는 ion만 ion source에서 detector까지 통과하도록 한다 이 quadropole의 전압을 바꾸면서 주어진 mass범위의 이온을 scanning 하여 mass spectrum을 얻는다.

5. MS tuning & Calibration

가. MS 사용전 tune 및 Calibration과정을 거친다.

나. Tune : 감도 및 resolution조절

다. Calibration : 정확한 질량보정

라.     Tune에 주로 쓰이는 reference gas는 PFTBA등이 쓰이며 안정적이며 휘발성이 높고 넓은 질량 범위에서 조각화 되는 장점이 있다. 당연하겠지만 tune의 변동이 발생하면 이전 작성한 검량선들은 사용할수 없다. 

 

 

Reference

http://en.wikibooks.org/wiki/Proteomics/Protein_Identification_-_Mass_Spectrometry/Instrumentation

영인과학

http://www.chromacademy.com/Quadrupole_Analyzers_and_MS_MS_Analysis_The_Essential_Guide.asp

http://www.fao.org/docrep/009/a0691e/A0691E05.htm

http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/quad-massspec.html

http://www.medicinescomplete.com/mc/checkforcookies.htm?uri=http%3A%2F%2Fwww%2Emedicinescomplete%2Ecom%2Fmc%2Fclarke%2Fcurrent%2Fc37%2Dfig%2D0005%2Ehtm
Perkin elmer GC/MS 교육 자료
http://www.google.co.kr/url?sa=t&rct=j&q=mass%20analyzer&source=web&cd=3&ved=0CF8QFjAC&url=http%3A%2F%2Fmgl.snu.ac.kr%2Fhtml%2Fgenetics-advance%2FChapter05.ppt&ei=wN1AT9usKIrumAXso_DMBw&usg=AFQjCNHDaBbtsK27j2HM8vpvgiTLBa_c4Q&sig2=OPTOjocK_Yi7H8xXOuhApA&cad=rjt

 첨부 파일.

Chapter05.pptx

d200403-5-02.pptx

GC-MS 및 LC-MS의 이해 및 응용-권영주.pdf

Mass_Analyzers.pdf

MS introduction good thread.pdf