[in progress] Elution-Extrusion CCC

앞으로 시간이 얼마나 걸릴지는 모르겠지만 HSCCC에 대한 이론적인 사항들을 나름 정리해서 올려보고자 한다.
눈으로 논문을 읽는것과 이렇게 글로 쓰는것은 천지차이란걸 알았기에 이렇게 올리는 이유도 있고..

EECCC는 특별한 기계나 부품이 아니다. 기존의 HSCCC apparatus를 활용할수 있다. 즉, 이것은 기기적인 측면이 아니고 단지 method적인 측면에서 분리의 범위를 확장시키는데 효과적인 방법이라 할수 있다. stepwise-elution HSCCC 와 더불어 개인적으로 감탄했던 방법이기도 하다, 왜냐하면 추가적인 기기나 부품이 필요없이 단지 생각하나만으로 효과의 극대화를 꾀했기 때문이다.

기존의 HSCCC-elution방법과 비슷하지만 EECCC가 작동될때 코일 내부의 용질의 머무름의 변화와 용리띠 모양의 변화가 몹시 궁금했다, 실제 실험을 해보아도 약간의 차이가 보였고 무엇보다 중요한 것은 Kd value의 적용이 가능한가? 여부이다.

이 글에서는 가능한 많은 내용을 정리하려고 노력하겠지만. 위와 같은 궁금증을 해소하기 위한 점에 초점을 맞추어 정리의 우선순위를 맞추었다.


참고 문헌은 다음과 같다.
[1] Elution-extrusion CCC : Theory & Concepts in Metabolic Analysis
Alain Berhod , J. Brent Friesen , Taichi Inui , Guido F. Pauli

1. Elution(용출) + Extrusion (분출) Counter-Current-Chromatography

CCC 는 고체상의 고정상이 아닌 액체의 고정상을 사용한다. 액체 자체적인 특성에 따라 넓은 범위의 극성을 커버할수 있는 장점이 있다. Giddings는 chromatographic column내에서 움직이는 solute band의 넓이는 오로지 band position "X"와 이론단수와 평형을 이루는 컬럼의 높이 "H"에 의존한다고 설명하고 있으며 이것은 SD(Gaussian peak의 표준편차) = (XH)^1/2 의  등식으로 풀이한다.

가우스 곡선 베이스 피크폭은 4∂(SD)와 같다.  따라서 solute는 컬럼에서 나오기전에 컬럼내에서 분리된다.

고정상의 액체의 성질을 이용하면 기존의 CCC보다 적은 용매로서 보다 효과적으로  solute를 회수할수 있다.

sample의 injection이후에 EECCC의 첫 단계는 전형적인 CCC단계이다. CM(classical mode) 컬럼 내부에서 이 방법에 따라 solute가 용출되고(예상되는 X_i위치에 있게 된뒤) 난뒤에 고정상을 이동상으로(최초 고정상을 이동상 같이 사용) 변환하는 단계로 넘어간다. 아래에서 설명하겠지만 고정상을 포함한 컬럼내의 solute들은 머무름의 증가에 따라 좁은 피크모양을 (줄어든 피크넓이) 나타낸다.
EECCC의 가장 큰 장점은 이와같이 고정상내부에 존재하는 solute까지 용출 시킴으로서 전 sample의 회수가 가능하다는 점이다.

2. EECCC의 이론적 접근

EECCC에서 solute의 Kd value 를 설명할수 있는 이론은 크게 2가지 이다.
1. VelMod ( velocity model )
2. VolMod ( Volumetric model )
두 model 다 CCC column 내부의 solute의 머무름을 설명하고자 하는데 그 목적이 있으나 이동하는 분석물질을 보는 관점에 따라 차이가 존재한다. ( 속도와 위치 vs 용출 부피 )

3. VelMod
평형상태에 있는 CCC 컬럼이 있다고 생각해볼때 , 컬럼(튜브)의 길이 (L) , 컬럼 부피(Vc) , 이동상의 부피 (Vm) 으로 표시를 해보자.

결과적으로 컬럼내 고정상의 부피는 Vs = Vc - Vm 로 나타낼수 있다.

머무름 부피라 불리우는 Vr ( solute i 의 머무름 부피 V_ri )는 다음과 같은 수식으로 설명 할수 있다.

V_ri = Vm + K_DiVs   ( eq 1 )

이 식을 다시 풀어보면 Kd=1인 solute의 Vr은 컬럼 부피 (Vm+Vs)가 된다고 이해할수 있다.

3-1 Elution 단계
Stage 1으로 대변되는 CM mode (classical mode) 에서 solute " i "의 속도 U_i는

U_i = F ( L / V_ri  )  ( eq 2 )

F : 이동상 flow rate
이러한 움직임은 이동상의 선속도(U_m)보다 느릴때 발생된다.  ( 흐르고 있는 이동상 속도 > 코일 내부 용질의 속도)

 U_m = F ( L / Vm ) ( eq 3 )

실험자는 이동상 부피 (Vcm/switch volume) 가 CCC column을 통과한 이후 용출단계의 종점을 선택한다. 이 시점에서 Vcm보다 적은 머무름 부피 (Vri)의 모든 solute (i)는 컬럼에서 용출된다. 동시에, 컬럼내에 여전히 존재하고 있는 solute들은 컬럼 inlet(입구)에서부터 거리 Xi 로 위치하게 된다.

Xi = L ( Vcm / V_ri )   ( eq 4 )

실제실험을 통한 결과는 100분에서 extrusion시작과 150분에서 extrusion시작의 결과가 제법다르다.(용출시간 & resolution ) 즉, 시간에따른 분석물질의 거동의 차이와 더불어 분배되는 정도도 차이가 발생한다.

3-2 Extrusion 단계
Extrusion part는 Vcm에서 시작하며 이 과정은 2개의 단계로 나누어진다.  왜냐하면 이 시점에서 코일내부에는 이동상과 고정상모두가 들어있기 때문이다. 무슨말이냐?
EECCC method 의 stage 2 의 첫 단계는 sweep elution 단계라고 할수 있는 과정이 시작된다. "쓸다"라는 단어뜻에서 비유하듯 이 이동은 컬럼 입구에서 출구까지 이동상 속도 U_m 으로 일어나며 이 속도는 모든 용질의 속도인 U_i 보다 빠르다. 고정상으로 밀기 시작했기 때문에 sweep elution에서 나오는 상은 이동상이다.(밀기 시작한 고정상이 나오기 전까지)  따라서 완전한 EECCC에 필요한 고정상의 부피는 Vm과 정확히 일치한다.

Stage 3 이 진행되는 동안 ( true extrusion, 코일내부가 모두 고정상으로 채워진 뒤 ) 비로소 고정상이 나오기 시작한다. 이때의 "나오는 고정상" 이란 남아있는 용질을 모두 포함하고 있는 Vc - Vm = Vs 의 Vs를 의미한다. 이 고정상은 선속도 :

Us = F ( L / Vc ) ( eq 5 )

를 가지게 된다. 주목할 만한 점은 stage 2에서의 고정상의 속도는 "0"란 것이다. (코일내에 머물러 있으니까)

3-3  Solute position inside the CCC column
extrusion단계가 시작되면 컬럼내로 들어가는 액체상은 이동상에서 고정상으로 바뀌게 된다. 결과적으로 용질은 eq 4에 의한 거리 Xi만큼 컬럼내에 위치하게 된다.
주어진 시간에 용질은 2가지의 가능한 과정중 하나로서 진행된다.
Process 1 : 전형적인 크로마토그래피 용출과정을 따라 용질은 2상 사이에서 분배되어 존재한 상태로 속도 U_i  (eq 2) 로 움직인다.
Process 2 : 고정상 만이 존재하면 용질은 단순히 고정상 속도 Us (eq 5 ) 에 따라 이동된다.
Extrusion ( stage 2 and 3 of EECCC ) 의 이론을 더 이해하기 위해서 알아두어야 할 점은 크로마토그래피의 용출과 선형이동과정간의 변화는 모든 용질에 있어서 동시에 일어나지 않는다는 점이다. 오히려 solvent front(stage2 sweeping elution)가 용질을 통과할때 속도 과정의 변화가 발생한다. (?) 이런 과정이 일어날때 까지 용질은 상대적으로 작은 범위에서 이동( △Xi )을 하게 되는데 이 과정은 고정상의 solvent front에 의해 잡히기 전(extrusion)까지 발생한다. 이 과정은 시간을 계산함으로서 예상 범위에 대한 문제를 해결할수 있다.

(  eq 6 )
 

 

앞서 설명한 식 1-3을 eq 6 에 넣어보자. 그러면.

 ( eq 7 )

이 식의 의미는 Sweeping elution 상태 에서 용질(이동상과 고정상모두의 solvent front 에 의해 잡히게 되는 용질)의 위치는 Xi + △Xi 의 거리에 위치한다. 

Xi + △Xi = LVcm /  K_Di Vs   ( eq 8 )

마지막에는 고려할 중요한 점은 고정상 앞부분(stationary front) 이 없이 컬럼을 나가는 용질 i 의 경우이다. 이것은 거리  Xi + △Xi 가 컬럼의 길이 L보다 더 긴 경우 즉, (stage 1에서 먼저 나오는 용질같은...)들이 이에 해당한다. 바꿔말하면 KDi 가 낮은 혹은 Vcm/Vs와 같은 용질에 적용된다.

3-4 Solute retention Volumes for Phase III
pure extrusion단계인 stage 3에서 빠져 나오는 compound의 머무름 부피는 용질에 의해 실제적으로 2가지의 과정과 연관된다.
Stage2의 전단계 ( previous stage2 ) 과정중 sweeping elution volume은 Vcm + extra mobile phase vol.( Xi + △Xi 만큼 용질이 빠져나오는) 이다.
그리고 실질적인 extrusion인 stage 3 에서는 컬럼 내로 진입하고 나올때의 고정상내의 거리 L - (Xi + △Xi) 로서  속도 Us 로 이동한다. EECCC의 yield인 V_EECCCi 는 다음과 같다.

V_EECCCi = Vcm + (Xi + △Xi )Vm/L + [ L - (Xi + △Xi )]Vc/L   ( eq 9 )

식 8,9 를 와 Vs = Vc - Vm 를 대입시키면 EECCC 내의 머무름 부피는 다음과 같이 정리된다.

V_EECCCi = Vcm + Vc - Vcm / K_Di
여기에 적용되는 용질의 K_Di 는 K_Di ≥ Vcm / Vs 이다 ( 물론 stage 3 단계 이다)

3. VolMod

 부피 표현으로서 용질의 위치를 묘사하는 대체 방법도 가능하다.