생리활성 물질의 분리, 정제

생리활성물질의 분리 정제

1. 서 론

활성물질의 분리, 정제 방법은 분리를 원하는 활성물질의 물리화학적 성질에 따라 달라져야 하며 여러가지 서로 다른 원리에 근거한 분리, 정제방법 중에서 적절한 방법을 효과적으로 조합하여야 한다. 일반적으로 동일한 원리에 근거한 방법으로는 성공적으로 활성물질을 분리, 정제하기 어렵다. 왜냐하면 동일한 원리에 근거한 분리, 정제 방법은 여러번 반복하여 사용하더라도 물질의 분리도는 어느 정도 높일 수 있으나 완전한 분리는 어렵기 때문이다. 또한 천연물로부터 항생물질 탐색 연구분야의 물질 분리, 정제 방법은 유기화학 또는 천연물 연구분야에서 행하는 방법과는 상당한 차이가 있다. 즉 유기화학 등의 분야에서는 이미 예상하고 있는 구조를 가진 화합물을 몇가지 다른 화합물과 섞여 있는 혼합물 중에서 분리하는 것이고, 천연물 연구분야에 있어서는 어떤 골격구조를 지닌 화합물, 즉 특정그룹의 화합물을 추적해 나가는 것이 일반적이다. 그러나 생리활성물질의 탐색 연구분야에서는 목적으로 하는 생리활성 물질 이외에 화학적으로는 전혀 모르는 수 백종의 화합물을 포함하는 미생물 대사산물 가운데서 생리활성을 지표로 하여 찾아 나가야 한다. 따라서 목표로 하는 화합물의 물리화학적 특성과 생물활성을 나타내는 분획(fraction)과의 빠르고 간단한 연결방법이 중요하다.

따라서 구조해석, 전임상실험 등에 사용할 시료 확보를 위한 본격적인 물질 분리, 정제를 행하기 이전인 활성물질 탐색의 초기 단계에서 목적으로 하는 활성물질의 신규성 또는 유용성을 미리 확인할 필요가 있다. 이를 위해서는 먼저 미생물 배양액으로부터 각종 생리활성을 검정한 후에 일반적으로 몇가지 유기용매에 대한 이행성, 활성탄 및 이온 교환수지에 대한 흡탈착성, pH와 열에 대한 안정성 등의 예비실험을 행한다. 일반적으로 이 시점에서 목적으로 하는 활성물질이 어떤 그룹에 속하는 물질인지를 판단하는 것이 어렵지만 예를들어 polyene계 항생물질은 UV spectrum 등으로 간단히 구별되기도 한다. 또한 대부분의 경우 이 단계에서 활성물질의 물리화학적 특성이 완전히 밝혀지기는 어렵지만 예비 추출시험에 근거하여 어느 정도 물리화학적 성질을 추정하고 이를 고려하여 소량의 활성물질을 분리한 후 신규물질 또는 기지물질 여부를 판단하게 된다. 이들을 효과적으로 screening 하기 위하여 종래부터 paper chromatography, UV spectrum 또는 각종 정색반응 등 여러가지 방법이 널리 이용되어 왔으나 특히 TLC(Thin Layer Chromatography) 방법이 screening의 초기 단계에는 유력한 수단이 된다. 이 방법에 의하면 신속성, 고도의 분리능등으로 인하여 활성물질의 분리, 정제 및 동정에 필요한 양을 간단히 얻을 수 있기 때문이다.

활성물질을 분리 정제해 나가는데는 정해진 방법이 확립될 수 없기에 풍부한 경험과 이론이 요구된다. 신속하고 효과적인 분리정제를 위해서 여러 종류의 resin, 활성물질, 용매들의 성질과 이들과의 상호관계를 알기 위해서 유기화학적 지식, 크로마토그래피 이론과 정제된 물질의 구조규명을 위해 NMR, IR, UV, MS 등을 이용한 기기분석 관련 지식을 기본적으로 습득해야 한다.

저자 등은 짧은 지면을 통하여 천연물로부터 활성물질을 신속하게 분리정제해 나가는 방법을 초심자도 활용할 수 있는 내용으로 실제 이용할 수 있는 실험적인 방법을 쉽게 기술하고자 한다. 이론적인 내용은 참고문헌에 수록된 서적을 참고하기 바란다. 본 장은 3부분으로 되어 있으며 첫번째 부분은 “활성물질의 초기탐색 단계에서의 분리정제”로 탐색의 초기단계에서 고려해야할 사항을 다루고 있으며, 두번째 부분은 “분리정제 방법과 그 조작법”으로 지용성물질과 수용성물질의 경우로 나누어 이들의 분리정제에 필요한 기술을 다루고 있다. 마지막 부분에서는 “분리정제의 실험예”로 활성물질의 실제 분리정제 과정을 보여줌으로써 이해를 돕고자 하였다.

2. 활성물질의 초기탐색 단계에서의 분리 정제

항생물질이란 용어에 대해서는 1942년 Waksman에 의해 “미생물로부터 생산되어 다른 미생물의 생육을 억제하는 물질”로 정의가 내려진 바 있다. 그러나 항종양성 활성물질, 살충 또는 제초활성을 포함하는 농용 항생물질, 면역활성 조절물질, 각종 효소 저해물질 등 다양한 생리활성물질들이 발견됨에 따라 “미생물에 의해 생산되어 미량으로써 각종 생리활성을 나타내는 물질”로 총칭되게 되었으며 최근에는 반합성 유기화합물과 동․식물 등에서 유래되었으나 기존 항생물질과 구조가 유사한 각종 생리활성물질도 포함시켜 광범위하게 해석하는 경향이라고 하겠다.

지금까지 각종 미생물의 탁월한 대사기능 연구 등을 통하여 15,000여종의 새로운 항생물질들이 보고되었으며 이 중에서 의약품, 가축 등의 동물용 약품, 농약 등으로 실용화된 경우도 많이 있다. 따라서 항생물질을 탐색하는 연구는 특정 병해를 예방하거나 치료하기 위한 명확한 목적을 지닌 응용과학 분야라고 할 수 있으며 미생물학, 생물학, 생화학, 약학, 화학, 의학 등 다방면에 걸친 종합적인 연구가 요구된다.

일반적으로 항생물질은 미생물의 배양액 중에 ppm 농도로 함유되어 있다. 이와 같이 미량으로 존재하기 때문에 탐색의 초기단계에서 효율적으로 활성물질을 분리, 정제하지 않으면 좋은 연구결과를 얻기가 아주 어렵다고 하겠다. 이러한 항생물질을 효율적으로 탐색하기 위하여 많은 요소가 필요하겠으나 여기에서는 가장 중요한 단계라고 할 수 있는 초기단계에서의 생리활성물질 분리, 동정에 대하여 알아보고자 하였다.

여기에서는 탐색 초기단계에서의 생리활성물질의 분리와 동정에 초점을 맞추어 활성물질의 분리, 동정시 고려할 사항들, 탐색 초기단계에서의 물질의 양적 개념, 예비 추출 실험방법, TLC의 유용성 및 이용 방법 등에 대하여 논하고자 하였다.

2.1 활성물질의 분리와 동정시 고려할 사항들

일반적으로 탐색 초기단계에서는 활성물질이 완전하게 분리, 정제되지 않은 상태에서 적은 양으로 신규성 확인 또는 기지물질로의 동정이 요구된다. 활성물질의 동정에 필요한 생물학적, 이화학적 특성들은 표 1과 같다. 이화학적 특성을 조사하기 위한 시료는 순도가 높아야 하는 반면에 생물학적 특성을 조사하기 위한 시료는 상대적으로 순도가 낮아도 큰 문제가 없는 편이다. 물론 순도가 높을수록 정확한 물질의 특성 파악에 유리하겠으나 탐색의 초기 단계에서는 가능한 한 순도가 낮은 상태의 시료를 가지고서도 물질의 특성에 관한 많은 정보를 획득하도록 노력하여야 한다. 왜냐하면 많은 경우에 물질의 분리, 정제가 용이하지 않으며 또한 시간이 많이 걸리기 때문이다. 즉 분리, 정제 실험에 치중할 것인지 분석에 치중할 것인지는 각 상황에 따라 잘 판단하여야 한다. 그러나 분자량 또는 분자식을 얻기 위한 MS 분석은 완전하게 분리된 시료를 사용하지 않으면 잘못 해석된 결과를 얻기가 아주 쉽기 때문에 주의 하여야 한다.

표 1. Identification parameters of bioactive compounds

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Biological characteristics :

Taxonomy of producing organisms

Spectrum of antimicrobial or other biological activities

Cross-resistancy

Chromatographic characteristics :

Paper chromatography

TLC (Thin Layer Chromatography)

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Physicochemical characteristics :

UV (Ultra violet) spectrum

IR (Infrared) spectrum

NMR (Nuclear magnetic resonance) spectrum

MS (Mass) spectrum

X-ray diffraction

Chemical degradation analysis

Computerised database :

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