I. Introduction (Reference 참조)
모든 세포는 살아가는 시간이 있음과 동시에 죽어야 되는 시간을 가지고 있다. 세포가 죽는 방법은 두 가지가 있다.
- 위험한 물질에 의해 죽는 것(Death by injury)
- 자살하도록 유도되는 것.(Death by suicide)
1. Death by injury
기계적인 손상이나 독성 화학물질에 노출되는 경우에 세포들은 죽을 수 있다. 이러한 경우에 세포들은 세포막의 물질투과성 통제력을 잃기 때문에 팽창하게 되고 세포 내용물이 빠져 나오며 유출된 내용물은 주변의 다른 조직을 감염시키게 된다.
2. Death by suicide
자살이 유도된 세포들은 다음의 과정을 보여준다.
- 움추려 든다.
- 미토콘드리아가 시토크롬C를 방출하고 분해된다.
- 세포 표면에 거품같은 수포를 형성한다.
- 핵이 분해된다.
- 작고 막으로 둘러싸인 조각으로 쪼개진다.
- 정상적일 때 세포막안에 숨겨져 있는 인지질인 포스파티딜세린인 표면에 노출된다.
- 대식세포 등과 같은 식세포의 표면에 있는 수용기가 이 조각들을 감지하여 삼키게 된다.
- 식세포들은 또 다른 감염을 방지하기 위하여 시토카인을 분비한다.
PCD는 유사분열처럼 세포들에게 본질적으로 존재한다.
(1) 왜 세포는 자살을 해야만 하는가?
두 가지 이유가 존재한다.
가. PCD는 유사분열처럼 정상적인 발달과정에서 필요하다.
예를 들면
- 올챙이가 개구리로 변대하는 과정에서 꼬리의 재흡수과정
- 태아의 손과 발에서 손가락과 발까락이 생길 때 사이에 있는 조직이 제거되는 과정
- 월경시작시 자궁 내벽이 떨어져 나가는 과정
- 뇌속에 존재하는 뉴런사이의 적절한 연결(시냅스)이 형성될 때 여분의 세포가 제거되는 과정
나. 개체에 위협을 가하는 세포들을 파괴할 때 필요하다.
예를 들면
- 세포가 바이러스에 감염되었을 때
cytotoxic T림프구(CTL)가 바이러스에 감염된세포를 죽이는 방법중에 하나가 자살을 유도하는 것이다.
- 면역계의 세포
세포매게 면역반응이 일어나면서 활성화된 세포들은 반응이 끝나고 나면 신체구성물질을 공격하지 못하도록 신속하게 제거되어야 한다. 이 일도 CTL이 유도하고 있는데 이러한 자살기작이 결핍되는 경우 자가면역증이 유발되기도 한다.
- DNA가 손상된 세포
게놈이 손상된 세포들은 탄생시 결손을 보여주거나 암으로 전이될 수 있다. DNA가 손상되게 되면 그 세포는 p53이라는 물질을 생산하는데 이 물질은 자살 유도체이다. 몇몇 암세포에서 p53 유전자의 돌연변이가 발견되었다.
- 암세포
암치료에서 사용되는 방사선과 화학약품이 어떤 종류의 암세포의 자살을 유도한다.
3. 무엇이 세포들로 하여금 자살하게 하는가?
계속 생존케하는 양의 신호(positive)를 거부하거나 죽게하는 음의 신호(negative)를 받아들임으로써 세포는 자살을 개시하게 된다.
(1) 양의 신호 거부
대부분의 세포가 계속 살기 위해서는 다른 세포들로부터 지속적인 자극을 받아들여야 한다. 이러한 신호에는 뉴런을 위한 성장인자와 림프구의 유사분열을 위한 필수 인자인 인터루킨-2 등이 있다.
(2) 음의 신호 수용
세포내에 산화물이 증가하는 경우와 이들 산화물과 자외선, X선, 화학치료약 과 같은 물질에 의한 DNA손상이 있을 때 발생되는 신호로 세포의 특수한 수용기에 결합하여 세포가 자살하도록 만들어 준다. 이러한 죽음의 활성인자에는 종양괴사인자(TNF인자; Tumor necrosis factor), 림포톡신(TNF의 일종), Fas ligand가 있다. 이 Fas ligand(FasL)는 Fas(혹은 CD95라 부르기도 함)에 결합한다.
4. 자살의 기작
2가지 기작이 존재한다.
- 세포내부에서 만들어진 신호에 의한 방법
- 세포수용기에 결합한 죽음활성자에 의한 방법. 죽음 활성장에 TNF, 림포톡신, FasL 등이 있다.
(1) 세포내부에서 만들어진 신호에 의한 방법
건강한 세포에서 미토콘드리아 외막에는 Bcl-2 단백질이 존재하고 있다. 이 단백질이 Apaf-1 단백질과 결합을 하고 있는데 세포내부에서의 손상으로 이들의 결합이 깨어지게 되면서 구조가 부실해져 미토콘드리아로부터 시토크롬C가 빠져나오게 된다. 떨어져 나온 시토크롬C와 Apaf-1은 세포질에 있는 카스파제9와 결합하게 된다. 이들 복합체(시토크롬C+Apaf-1+카스파제9+ATP)를 apoptosome이라고 한다. 이 아폽토솜이 세포질에 쌓이게 된다.
카스파제9는 12개 넘는 카스파제 중 하나이다. 이들은 모두 프로테아제로 아스파르산 잔기를 끊는 기능을 가지고 있다. 카스파제9는 다른 카스파제를 활성화시켜준다. 결국 계속되는 활성화로 이들의 단백질 분해 활성은 매우 크게 증가하게 되어 세포질의 구조단백질의 분해가 일어나고 염색체의 분해가 일어나게 된다. 그 후 다른 세포에 의한 식세포 작용으로 마감되게 된다.
(2) 세포수용기에 결합한 죽음활성자에 의한 방법
Fas와 TNF 수용기는 세포 표면에 존재하는 내재성 단백질들이다. 이들은 죽음의 활성인자와 결합하여 신호를 세포질로 전달하여 카스파제8의 활성을 유도한다. 이 카스파제8도 9처럼 세포의 식세포 과정을 촉진시켜 준다.
예를 들어 cytotoxic T세포가 그들의 목표물을 인식하게 되면 이들은 더 많은 FasL을 표면에 뿌리게 되어 목표세포의 Fas수용체에 결합하여 세포 자살이 일어나게 된다.
참조 :
Growth factor signaling (epidermal growth factor)
Prostaglandin production (COX-2)
Inflammation (inflammatory cytokines/ NF-kB, TNF, IL-1, IL-6, chemokines)
Drug resistance gene products
Cell cycle proteins (Cyclin D1, Cyclin E)
Angiogenesis (vascular endothelial growth factor)
Invasion (Matrix metalloproteinase)
Antiapoptosis (Bcl-2,bcl-X/L, XIAP, survivin, FLIP)
Cellular proliferation (c-myc, AP-1,growth factors)
II. 관련 assay
1. LDH-release assay
Lactate dehydrogenase (LDH) is a soluble cytosolic enzyme that is released into the culture medium following loss of membrane integrity resulting from either apoptosis or necrosis. LDH activity, therefore, can be used as an indicator of cell membrane integrity and serves as a general means to assess cytotoxicity resulting from chemical compounds or environmental toxic factors.
세포에서 방출한 젖산 탈수소효소 (Lactose dehydrogenase : LDH)를 고감도로 측정하므로써 세포손상을 측정하며, kit로 나와있다.
LDH는 세포질에 존재하는 효소로 통상은 세포막을 통과하지 않으나 세포막이 손상되면 세포 외부 즉 배지 중으로 방출된다. 본 키트를 사용하므로써 방출된 LDH를 다음과 같은 원리로 측정할 수 있다. LDH는 젖산의 탈수소화를 촉매 작용해 pyruvate와 NADH를 생성한다. 이 NADH는 diapholase의 촉매에 의해 테트라졸리움염 (INT)을 환원시켜 490 nm의 흡수를 갖는 적색의 formazan 색소를 형성한다. 따라서, LDH 활성을 490 nm의 흡광도의 증대로 측정할 수 있다.
2. Caspase assay
Caspase-3, -9등에 의해 절단되는 DEVD-pNA(-3), LEHD(-9)은 강한 형광을 나타내는 기질이다. 이것을 측정한다. kit로 나와있다.
3. Flow cytometry
유액(流液)상태의입자(Particle) 나세포(Cell) 가일정감지지역(sensing area)를통과할때각각의입자나세포가갖는여러특징을동시에측정하는방법.
프로그램에 따라 다양한 실험 응용이 가능하다. Cell cycle analysis에서 sub-G1 peak은 apoptotic portion을 갖는다고 알려져 있다.
그 이유는 Apoptosis가 일어나는 동안에는 calcium-and magnesium-dependent nuclease들이 activation 되면 서 DNA를 절단하게 된다. 그것으로 인해 잘려진 작은 DNA절편들은 실험과정 중 PBS와 같은 washing buffer에 녹아 나와 washing 단계에서 제거되게 된다. 그러므로 apoptosis가 일어난 세포를 정량적인 DNA-binding dye인 PI를 사용하여 염색해 보면 apoptosis에 의한 DNA fragmentation 현상에 의해 세포내에 존재하는 DNA양이 줄어들어 덜 염색되고 세포주기의 G1 peak 왼쪽에 sub-G1 peak를 형성하게 된다.
4. Capillary tube formation assay
**HUVEC Cell(혈관내피세포)**------------------------------------------------------------------------------------
HUVEC are isolated from the vein of the umbilical cord and are commonly used for physiological and pharmacological investigations, such as macromolecule transport, blood coagulation, angio- genesis, and fibrinolysis.
PromoCell offers HUVEC from single donors or pooled from up to four different donors. (Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAEC) from the same donor are available on request). In addition, HUVEC are available which are pre-screened for angiogenesis and other VEGF (vascular endothelial growth factor) dependent signaling studies.
They have been positively tested for VEGF response using PromoCell´s unique 3D-Angiogenesis Assay. VEGF is an important signaling protein involved in both vasculogenesis and angiogenesis. In vitro, VEGF has been shown to stimulate endothelial cell mitogenesis, cell migration, sprouting, and microvascular permeability.
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The assay measures the ability of endothelial cells, plated at subconfluent densities with the appropriate extracellular matrix support, to form capillary-like structures (a.k.a tubes). Scientists typically employ this assay to determine the ability of various compounds to promote or inhibit tube formation. Compounds that are able to inhibit tube formation could be useful in various diseases, such as cancer, where tumors stimulate new blood vessel formation to receive oxygen and nutrients in order to grow beyond a relatively small size.
Upon plating, endothelial cells attach and generate mechanical forces on the surrounding extracellular support matrix to create tracks or guidance pathways that facilitate cellular migration. The resulting cords of cells will eventually form hollow lumens
The advantages of this assay are that it is relatively easy to set up, requires a short culture period, is quantifiable, and is amenable to high-throughput analysis. A disadvantage of this assay is the large variation of tube-forming capability among different lots of endothelial cells and support matrices, which makes the selection of these resources crucial to obtaining consistent and reliable data. While this assay is essential, users are cautioned that results should be confirmed in vivo because commercially available endothelial cells have been pre-selected for their proliferative capacity and there are no heterospecific cell interactions being represented. It has also been reported in the literature that certain non-endothelial cell types demonstrate tube formation, which suggests that tube formation by endothelial cells may not represent true differentiation of this cell type.
Ref.
http://kimwootae.com.ne.kr/generalbiology/apoptosis.htm
https://www.qiagen.com/geneglobe/pathwayview.aspx?pathwayID=99
http://www.caymanchem.com/app/template/Product.vm/catalog/10008882
http://www.kmle.co.kr/search.php?Search=LDH
http://www.ksabc.or.kr/admin/contribute/journal/kpaper/2006_49_4_270.pdf
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21130827
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