유전자 염기서열을 이용한 종 감별

많은 생물들이 진화를 계속해 오는 과정에서도 변화가 가장 적고 안전하게 유전적 특성이 유지되는 rDNA (Ribosomal DNA)의 염기서열의 비교연구는 넓은 범위의 분류수준에서 유연관계를 분석하는데 가장 유용하다. 진핵 세포의 rDNA는 코딩영역과 비코딩영역으로 구성되어 있다.

또한 rDNA는 진화에 보존적인 영역과 다른 영역보다 빠르게 진화하는 ITS(Internal transcribed spacer)영역 IGS(Intergenic spacer)영역이 있는것으로 알려져 있다.

SSU rDNA(Small-subunit rDNA sequences)는 느리게 진화하므로 계를 연구하는데 유용하지만 미토콘드리아 rDNA는 더 빠르게 진화하므로 과의 분류에 이용될 수 있다.

ITS와 IGS영역은 각각 다른 비율로 진화하며 구조와 특징이 규명되었다. rDNA의 코딩영역은 진화에 보존적이지만 비코딩영역은 종간에 다양성이 있다.

진핵세포의 rRNA유전자 (rDNA)의 전사단위는 18S, 5.8S, 28S의 순으로 되어 있으며 각각의 rDNA사이에 2개의 ITS영역으로 분리, 연결되어 있다.

ribosome은 rRNA 분자들과 단백질로 구성되어 있다. 이 rRNA 분자들은 원핵이나 진핵에서 그 크기가 다르다. 그들의 크기는 S값으로 나타내져 있다..(S는 Svedberg단위로서 S값은 분자의 크기와 비례한다.) 원핵세포의 ribosome은 23S, 18S, 5.8S, 5S rRNA 분자들을 갖고 있고 진핵의 세포성(소기관에서는 존재하지 않음) ribosome은 28S, 16S, 5S rRNA 분자들을 갖고 있다. 여기서 말하는 진핵은 고등진핵세포의 ribosome을 의미한다.

ribosomal RNA는 세포내에서 단백질을 합성하는 ribosome을 구성한다. 진핵 및 원핵 세포에서 ribosome에서 일어나는 대부분의 과정들은 거의 같고 다른 것은 크기이다. 진핵 및 원핵 세포의 ribosome들은 매우 비슷하게 구성되어져 있다. 진핵생물에서 rRNA는 다른 RNA와 달리 인에서 전사된다. 전사에 관여하는 DNA는 인 형성부위에 있으며 이 부위에는 rRNA에 관여하는 여러 사본의 유전자가 있다. 이와 같이 많은 수의 똑같은 유전자가 필요한 이유는 때에 따라 rRNA의 요구량이 많아지기 때문인 것으로 생각된다. 따라서 많은 양의 rRNA가 요구될 때에는 많은 수의 RNA 중합효소가 이들 유전자들을 따라 이동하면서 계속 RNA를 만들어 낼 수 있다.

초기에는 5.8S 부위에 대한 염기서열의 비교가 분류의 근거로 주로 이용되었다. 그러나 이 부위는 염기서열 길이가 상당히 짧고 매우 보존적인 부위이기 때문에 관련된 종 간에는 거의 동일한 염기서열을 나타내므로 이 들 상호간의 분류네는 사용할 수 없는 어려움이 있다.

분자생물학적인 실험 기법의 발달과 더불어 다른 고등 균류 사이에서의 계통분석에 18S rDNA염기 서열을 이용하고 있다. 18S 및 28S rDNA는 통계적으로 신뢰성이 있는 정보를 가지고 있으며 염기 보전이 높은 부분 중간 부분 변이가 심한 부분이 공존하므로 계통분화를 논하는데 적합한 수단으로 취급되었다.

그러나 18S와 28S는 염기서열 길이가 길어서 염기서열을 결정하기 위해 많은 시간과 노력을 요구하고 부분염기서열은 보다 광범위한 계통발생학적 진화관계를 가지는 속간의 비교에는 대상으로 하는 염기서열의 부족으로 분류지표로 이용될수 있는 정보량이 적은 난점이 지적되었다.

반면에 ITS영역은 가운데의 5,8S부분을 포함하여 500~800bp 정도로 그 염기서열을 결정하기가 간편하고 시간적 제약을 덜 받기 때문에 다수의 균종을 대상으로 하는 분류학적 연구에 적합하며 그 분자진화 속도가 빨라 염기서열의 다양성을 요구하는 종, 속의 분류에 적합하다. 더구나 보존성이 높은 5.8S부위를 포함하고 있으므로 ITS부위와의 각각의 비교가 가능하며 이러한 풍부한 정보량과 간편성으로 동일 속 내의 종 간 및 속 간의 유연관계의 연구에 유용한 수단이 되어왔다. 또한 계통의 분석을 위하여 이용될수 있다.

식물에서의 완성된 rRNA는 그들의 크기와 기능장소를 통하여 특징지어진다. Cytosol 에는 25S-, 5,8S-, 그리고 5S- 형이 리보솜에 큰 subunits로 존재하고, 18S-형이 작은 subunit로 존재한다. 미토콘드리아 속에는 24S-, 5S-가 큰 subunit로 18S-형이 작은 subunit로 존재한다.

DNA를 증폭하여 진단에 사용하려면 유전자의 어느 부위를 목표로 하느냐가 가장 중요하며 유전자의 복제 수(copy number),증폭할 부위의 크기, 특이성 등을 고려하여야 한다. 목표로 하는 유전자가 다복제(multi-copy)인 경우 단복제(single-copy)보다 감수성이 높다.

진균의 경우, 종특이 primer4,5는 여러 균종에 오염된 경우 유용하며 특이성이 높다. 그러나 대부분 단복제이므로 감수성이 낮 고 , 균종마다 특이primer/probe를 만들어야 하는 번거로움이 있으며, 알려져 있지 않은 균종에 대해서는 검사를 시행하지 못하는 단점이 있다. 모든 진균을 검출할 수 있는 범진균 (universal fungal) primer를 이용하여 진균 DNA를 증폭 후 염기서열을 분석하거나, 종특이 표식자(species-specific probe)를 사용하여 균종을 구분하는 것이 임상적용에 적합하다.

Ribosomal RNA gene (rDNA)의 ITS 부위는 종특이 probe를 제작하는데 알맞다(그림 1). 5종의 Candida에서 5.8S와 18S의 상동성은 평균 97%로 비교적 차이가 없는데 비해,6,7 ITS2의 3' 부위는 40%의 상동성을 나타냈으며, 동일균종내 균주간에는 차이가 없었다. Duggal 등8은 6종의 Fusarium에서18S와 28S에 비해 ITS에 더 많은 다형성(polymorphism)이 있으며, ITS 부위의 염기서열을 비교하여 균종간에 차이가 많음을 밝혔다.

효모균에서는 염기서열의 변이가 심한 ITS1에 비해 ITS2 부위가 균동정에는 적합하다고 한다.

>>Arrangements of rRNA gene repeating units in yeast. rDNA is transcribed to rRNA precusor. ETS and ITS are removed by endonuclease and splicing. 18S and ribosomal proteins become SSU. 5.8S, 28S and 5S become LSU. NTS is not trascribed, and includes promoter and enhancer. Intergenic spacer(IGS) include NTS and ETS. NTS : Non Transcribed Spacer; ETS : External Transcribed Spacer; ITS : Internal Transcribed Spacer; SSU : Small Sub Unit of ribosome; LSU : Lage Sub Unit of ribosome

증폭된 DNA의 염기서열을 알 수 있으면 가장 많은 정보를 얻을 수 있는 장점이 있지만 시간과 비용이 가장 많이 든다. ITS 부위 염기서열 분석이 균종의 동정에 많이 이용되고 있다. 다양한 균종들의 ITS 염기서열이
보고되어 있으며, 미지의 균을 동정하기 위하여 범진균 특이 primer로 ITS 부위를 PCR 증폭한 후 염기서열을 BLAST (basic local alignment search tool)를 이용하여 GenBank database와 비교하면 균종을 동정할 수 있다.

Genomic DNA란?
어떤 생물종의 전체DNA를 Genomic DNA라고 함, Plasmid DNA , cDNA와 구분하여 사용하는 말.
(예) 인간일경우 : 23개의 염색체 세트를 genome이라 함

Gene(유전자)란?
유전자란 말은 DNA 중에서 단백질로 정보가 표현되는 부분을 말하는데, 정의를 내리자면, 한 세대에서부터 다음 세대로 그 개체의 모든 생물학적 정보를 전달해주는 물리적, 기능적인 단위

Plasmid DNA란?
Plasmid는 박테리아 세포 내에 독립적으로 존재하는 환형의 DNA 분자

Primer?

염기쌍 형성에 의해 단선 주형분자에 부착될때 DNA polymerase에 상보 strand의 합성의 시작부분으로 작용하는 oligonucleotide

Vector?

유전공학에서 재조합 DNA를 세포내로 운반하는 전이체. 플라스미드와 박테오파지가 주로 이용

생명체들의 진화적 차이 및 서로간의 상관관계를 비교하기 위해서는 현재 원핵생물들은 16S rRNA의 염기서열, 그리고 진핵생물의 경우에는 18S rRNA의 염기서열을 비교하고 있다.

▣ Base-pair : The size of an individual gene or an organism's entire genome is often measured in base pairs because DNA is usually double-stranded. Hence, the number of total base pairs is equal to the number of nucleotides in one of the strands (with the exception of non-coding single-stranded regions of telomeres). The haploid human genome (23 chromosomes) is estimated to be about 3.2 billion base pairs long and to contain 20,000–25,000 distinct genes.^[1]^[2]^[3] A kilobase (kb) is a unit of measurement in molecular biology equal to 1000 base pairs of DNA or RNA

▣18S ribosomal RNA (abbreviated 18S rRNA) is a part of the ribosomal RNA. The S in 18S represents Svedberg units. 18S rRNA is a component of the small eukaryotic ribosomal subunit (40S). 18S rRNA is the structural RNA for the small component of eukaryotic cytoplasmic ribosomes, and thus one of the basic components of all eukaryotic cells.It is the eukaryotic nuclear homologue of 16S ribosomal RNA in Prokaryotes and mitochondria.The genes coding for 18S rRNA are referred to as 18S rDNA. Sequence data from these genes is widely used in molecular analysis to reconstruct the evolutionary history of organisms, especially invertebrates, as its slow evolutionary rate makes it suitable to reconstruct ancient divergences

디엔에이(DNA) 바코드 마커로서 ‘리보솜 디엔에이(DNA) 아이티에스(ITS, internal transcribed spacer)가 활용된다.

○ 디엔에이(DNA) 바코드란 사람의 지문처럼 종간 변이가 커서 종을 구분하는데 사용되는 디엔에이(DNA) 염기서열 부위로, 이를 이용 하면 생물종의 이름, 서식지, 습성 등과 같은 생태정보를 쉽게 알아낼 수 있다.

○ 동물은 미토콘드리아에 있는 ‘시토크롬산화효소1(CO1)’ 유전자가, 식물은 엽록체에 있는 ‘matK(MaturaseK), rbcL(Rubisco large)’두 개의 유전자가 디엔에이(DNA) 바코드 마커로 선발돼 사용되고있 다.

▣ITS (for internal transcribed spacer) refers to a piece of non-functional RNA situated between structural ribosomal RNAs (rRNA) on a common precursor transcript. Read from 5' to 3', this polycistronic rRNA precursor transcript contains the 5' external transcribed sequence (5' ETS), 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA and finally the 3'ETS. During rRNA maturation, ETS and ITS pieces are excised and as non-functional maturation by-products rapidly degraded. Genes encoding ribosomal RNA and spacers occur in tandem repeats that are thousands of copies long, each separated by regions of non-transcribed DNA termed intergenic spacer (IGS) or non-transcribed spacer (NTS).

**원핵생물과 진핵생물의 비교**
	원 핵 생 물	진 핵 생 물
소속 생물의 예	Bacteria, Archaea	Algae, fungi, protozoa, plant animal
1. 핵 구조와 기능
핵막	없음	있음
인	없음	있음
DNA	하나의 분자: histone과 연결 안됨	여럿 또는 많은 염색체로 존재. Histone과 복잡한 결합
분열	무사분열	유사분열
유성생식	절단과정:감수분열 없슴	정상과정:감수분열;염색체의 보충
Introns in genes	Rare	Common
2. 세포질 구조와 구성
원형질막	보통 sterol이 없음	보통 sterol이 있음
내부막	비교적 간단: mesosome	복잡: 소포체(ER), 골지체
리보소옴	70S의 크기	80S(미토콘드리아 리보오솜:70S)
세포내 소기관	없음	액포, lysosome, microbodies
호흡계	원형질막 부분, 메소소옴	미토콘드리아
광합성기구	내부막 또는 액포	엽록체
세포벽	대부분 있음(peptidoglycan)	식물, 조류, 곰팡이:있음, 동물, 원생동물:없슴
내생포자	약간 있음:내열성	없음
공포	약간 있음	없음
3. 운동형
편모운동	편모:현미경으로 관찰 안됨, 회전	편모 또는 섬모:현미경 관찰, 회전하지 않음
비편모성 운동	미끄러움 운동	세포질 유동돠 아메바 운동
4. Microtuble	아마 없음	널리 분포:편모, 섬모, 기부, 방추사, 중심체
5. 크 기	일반적으로 작음, 보통 <2 μm 직경	보통 큼, 2~100 μm 직경

실험방법은 Ref 3.의 실험법을 참고...자세히 설명되어 있어 매우 유익함.

>> PCR (polymerase chain reaction) <<

DNA의 증폭을 위해서 PCR이 많이 이용된다.

1. 반응조건
PCR은 통상적으로 다음 세 가지 반응단계로 이루어져 있다

(1) DNA변성(Denaturation)
일반적으로 두가닥 DNA를 94℃에서 15~30초간 처리하 여 각각 한가닥 DNA로 분리시킨다. 너무 온도를 높이거
나 처리시간을 지나치게 늘리면 내열성 DNA polymerase라 해도 활성을 잃게되므로 주의가 필요하다.

(2) Primer의 Annealing
열처리로 한가닥으로 변성한 DNA와 primer를 공존시킨후 온도를 낮추면 2종류의 primer는 각각 상보적인 한가
닥 주형 DNA에 annealing한다. Annealing에 가장 적합한 온도와 시간은 primer의 염기배열과 그 길이에 따라 결정되지만 일반적으로 55℃에서 30초~1분간 annealing한다. Annealing 온도를 높이면 primer-주형 DNA의
mismatch가 감소되어 반응 특이성이 높아진다. 그러나 혼합 primer 또는 mismatch를 갖는 primer를 사용할 경우는37~45℃로 annealing 온도를 낮출 필요가 있다.

(3) 신장반응(Extension)
4종류의 기질(dNTP)이 공존하는 상태에서, DNApolymerase를 작용시켜 primer를 신장시킨다. 신장반응
에 필요한 시간은 주형 DNA의 농도, 증폭단편의 크기, 반응온도에 따라 좌우되지만 일반적으로는 Thermus
aquaticus(Taq) polymerase를 사용할 경우 72℃에서30초~10분간(증폭크기 약 10 kbp)처리한다. Taq polymerase에 의한 DNA 합성속도(약 60 nucleotides/sec, 70℃)1)를고려하여 시간을 설정한다.최근 primer의 annealing 단계, 신장반응 단계를 동일한온도에서 하는 shuttle PCR도 실행되고 있다.

예) 94℃ 30초 (변성단계)
60~68℃ 1~10분(annealing, 신장단계)
25~40 cycles
Shuttle PCR을 함으로서 반응

(4) Cycle 수
PCR의 경우 n회의 cycle로 표적배열은 2n배가 되지만 실제로는 이보다 낮다. 효율이 저하되는 이유는 ① DNA
polymerase의 실활 및 증폭단편(주형DNA)의 증가로 인한 효소분자/주형비의 부족, ② 증폭단편간의annealing되는 속도가 빨라져서 primer의 anneal과 경합한다, ③ Pyphosphate 축적으로 인한 효소반응 저해 등이 일어날 수 있다. 일반적으로 25~35 cycles의 반응이 이루어지지만 증폭산물이 증가되면 그 자신이 primer가 되어 2차적인 반응이 일어나기 쉬우므로 비특이적인 DNA의 증폭을 일으키게 된다. 따라서 반응 cycle 수를 불필요하게 증가시키는 것은 바람직하지 않다. 물론 반응개시의 경우 주형 DNA량이 미량일 경우에는 일반적인 경우보다 cycle 수를 늘릴 수 있다. 최근에는 1 copy로부터 PCR도 가능하게되었다. 이 경우는 단지 반응 cycle수를 증가시키는 것이아니라 nested PCR을 실행한다. 이것은 1회째의 PCR산물을 희석하여 주형으로 삼고 primer의 안쪽에 설정된 다른 primer를 사용하여 2회째 PCR하는 것이다. 또한random primer를 사용하여 주형 DNA를 증폭하는primer extension preamplification(PEP법)이 고안되었다2). 이것은 시료 DNA를 주형으로 하여 우선 임의의 서열을 갖는 짧은 primer(9~15 mer정도)를 사용한 비특이적인 신장반응으로 주형 DNA의 거의 모든 영역을 증폭한 다음 그 일부를 주형으로 하여 1회 더 primer 특이적 PCR을 하는 것이다.

2. 반응액의 조성
(1) 내열성 DNA Polymerase
수 종류의 내열성 DNA polymerase가 시판되고 있는데 반응에 사용하는 완충액의 조성이 다를 수 있으므로 주의가 필요하다. TaKaRa Taq을 사용할 때 DNA합성의 최적온 도 는 대 개 70~80℃ 이 고 그 합 성 속 도 는 60
nucleotides 이상/초이다. 활성 반감기는 92.5℃에서 130분 이상, 95℃에서 약 40분, 97.5℃에서 약 10분간이다.

(2) Mg2+ 농도
일반적으로 PCR반응에서는 1.5~2.5 mM의 Mg2+ 농도가 필요하다. Mg2+ 농도는 PCR을 실행할 때 다음의 사항에 관여하고 있는 것으로 여겨진다. ① 효소활성, ②primer의 annealing, ③ 합성된 DNA의 충실성, ④primer-dimer의 형성 등이다. 킬레이트제(예를 들면EDTA)는 반응액 속의 Mg2+ 농도에 영향을 미치므로 주형으로 사용하는 DNA 용액에서 turn over하는 것에 주의할 필요가 있다. 또한 유효한 Mg2+ 농도는 dNTP 농도와도 관계가 있으므로 어느 실험에서나 최적 Mg2+ 농도를 결정하고자 할 경우 항상 dNTP 농도를 고려해야 한다. 일반적으로 Mg2+ 농도가 높아지면 DNA 합성의 정확도에 영향을 미칠뿐만 아니라 두가닥 DNA 변성이 어려워지고, Taq
polymerase는 10 mM MgCl2에 의해 40~50%의 저해를 받으므로 MgCl2를 과잉 첨가하는 것은 바람직하지
않다.

(3) dNTP
PCR의 효율, 특이성면에서 보면 20~200 μM에서 양호한 결과를 얻을 수 있다. DNA polymerase가 잘못된 dNTP를 사용하는 mismatch 현상은 dNTP 농도에 강하게 의존 한다3,4). dNTP 농도를 낮추는 쪽이 PCR 특이성과 정확도가 높아지므로 dNTP 농도를 낮추면 misprimming이 감소하여 PCR의 정확도가 높아진다5). 단 사용하는 Mg2+ 농도에 따라 dNTP의 최적농도가 달라지므로 주의가 필요하다.

(4) 주형 DNA, RNA
PCR법은 여러 가지 형태의 DNA와 RNA를 주형으로하여사용할 수 있다. 가장 간편한 DNA 조제법으로는 소수의
조직배양 세포를 비등한 증류수 속에서 가용화하여 PCR에 사용하는 방법이다6). 또한 사람의 한 가닥의 머리털로부터 PCR 증폭하는 다형분석7), 포르말린으로 고정한 파라 핀포매조직 조작으로 PCR도 실시하고 있다8,9). 혈액에서 주형 DNA를 조제할 때는 헤모글로빈이나 포르피린 기타 미지물질이 PCR 반응을 저해하는 점에 주의가 필요하다.

10). 최근 법의학 분석에서 전혈 또는 머리털을 마이크로파처리하여 그대로 PCR에 이용한다는 보고도 있다11). 주형 DNA 양으로는 1단계 PCR에서 105~106 분자에 상당하는 양이 있으면 양호한 결과를 얻을 수 있고 3×105개의 분자는 human genome DNA에서는 1 ㎍, 효모 DNA에 서는 10 ng, 대장균 DNA에서는 1 ng에 상당한다. 그러나 앞에서 기술한 바와 같이 nested PCR, PEP법을 이용하면 1분자 DNA로부터의 PCR도 가능하다. RNA를 우선 역전사 효소로 cDNA로 변환한 후에 PCR을 하는 방법을 일 반 적 으 로 RT-PCR(Reverse Transcription-
Polymerase Chain Reaction)이라 한다. 소수의 세포로 부터의 mRNA 또는 극히 미량밖에 발현되지 않은 mRNA
의 검출, 반정량에 사용할 수 있다. 또한 RT-PCR은 임상시료에 따라 다수의 세포를 얻기 어려운 경우, 소수의 세포로부터 완전한 cDNA cloning 하는데도 유용하다. RTPCR용 시료의 정제용으로 Catrimox-14는 양이온 계면활성제로서 세포를 용해하여 RNA와 DNA 복합체를 형성한 이 복합체에서 간편한 방법으로 보다 효율 좋게 RNA
를 회수할 수 있고, 또한 Catrimox-14는 ribonuclease 저해작용을 하기 때문에 혈액,14) 동물 배양세포,15) 동물 조직으로부터의 RNA 추출에 매우 유효하다.

(5) 반응첨가물
많은 염기배열을 복수의 primer set를 사용하여 동시에 1개의 반응 tube 내에서 PCR 증폭하는 방법을 다중
PCR(multiplex PCR)이라 한다. 근육병의 원인인 디스트로핀 유전자의 결실변이를 18종류의 primer를 사용하
여 검출할 수 있다16). 일반적으로 multiplex PCR반응액에는 10%(v/v) dimethylsulfoxide(DMSO)를 함유한다
17). 유기용매는 보통 Taq polymerase에는 적합하지 않지만 multiplex PCR에는 필수적이다.
Taq polymerase의 저해물질로서 SDS(<0.01%)가 알려졌으나, 비이온 계면활성제 Tween-20이나 nonidet-P40
의 첨가로 그 저해를 억제할 수 있다. 또한 DMSO(2~5%),PEG6000(5~15%), 글리세롤(5~20%), 포름아마이드
(5%)나 BSA(bovine serum albumine)첨가로 반응 촉진효과를 얻을 수도 있다.

PCR로 증폭된 DNA를 바로 sequencing하기에는 정확한 결과를 얻기 힘들다. 기본적으로 PCR산물은 순도가 높지 않다. 따라서, 원하는 부위를 선별해서 이 부위를 증폭해야 하는데 이떄 cloning과정을 거치게 된다.

Vector cloning기법을 쓰게 되는데 vector의 기능은 다음과 같다.

1) 세포내에서 자가 복제를 한다.

2) 항생제를 이용한 선택이 가능하다.

3) MCS(multiple cloning site)를 이용할 수 있다.

4) Vector부위를 이용한 DNA sequencing, 단백질 발현등을 할 수 있다.

Vector의 종류는 다음과 같다.

1) Plasmid

2) Bacteriophage

3) Cosmid

4) Phagemid

Ref