Now or Never

초대장 드립니다(10분)

Acidrain — Sun, 27 Jan 2013 22:47:37 +0900

간만에 초대장 드리고자 글 올립니다.

성실하게 블로그 운영하실 분이면 댓글을 달아주세요

1주일 후에 선정하여 초대장 드리도록 하겠습니다.

즐거운 한 주 시작하세요!

Cystic fibrosis

Acidrain — Mon, 21 Jan 2013 00:26:59 +0900

낭포성 섬유증(囊胞性纖維症, Cystic fibrosis, CF, mucoviscidosis)은 상염색체 열성 유전성 질환이다. 주로 허파에 큰 문제를 일으키며, 이뿐 아니라 이자, 간, 창자에도 영향을 미친다. 상피 조직을 통해 염화 이온과 나트륨을 운반하는 데 이상이 생기는 것이 특징이며 이 까닭에 두껍고 끈적거리는 점막이 만들어진다

1. 정의 및 역사

1) 정의

낭포성 섬유증은 백인에게서 흔하게 나타나는 치명적인 유전성 질환이다. 낭포성 섬유증은 체내에서 점액의 과생산으로 인한 폐의 이상(infection)과 췌장의 이상을 유발하여 소화효소가 소장에 도달할 수 없게 만든다. 또한 환자의 땀에서의 염분의 양이 변하게 되며 생식기관의 이상도 수반된다. 낭포성 섬유증의 발병빈도는 유럽의 경우 2000~2500명당 1명의 꼴이다.

2) 역사적 변천

낭포성 섬유증이 1930년대에 발견되었을 때에는 이 병의 원인에 대해서 아무도 몰랐기 때문에 낭포성 섬유증에 걸린 아이들은 유년 시절을 넘길 수 있는 가망성이 거의 없었다. 불과 30년 전까지 낭포성 섬유증 환자의 평균 수명은 8세에 지나지 않았다. 그러나 현재는 낭포성 섬유증 환자의 평균 수명은 31세이다. 수명이 증가했을 뿐만 아니라, 낭포성 섬유증을 가지고 있는 아이들은 새로운 치료 방법으로 인해서 향상된 삶을 누리고 있다. 이러한 치료 방법을 개발하기 위해서 과학자들은 분자 수준에서 질병을 연구하고 있다. 그리고 9월 18일자 네이처에는 하워드 휴 의학 연구소의 과학자들이 낭포성 섬유증의 원인을 이해하는 데 도움이 되는 연구 결과를 발표하였다.

출처 : http://www.nature.com의 science update : 1997년 09월 25일

2. 진단 및 유형

1) 진단

낭포성 섬유증의 진단은 땀에서 염소이온을 측정하거나 폐의 감염, 췌장의 이상 등의 특이적 증상으로 진단할 수 있다. 분자유전학적으로는 위에서 언급한 CFTR 유전자의 돌연변이를 검색하는 것으로 진단할 수 있으며 이는 산전 진단에도 사용된다. 또한 신생아의 혈청에서의 immunoreactive trypsin(IRT)의 증가로 진단할 수 있다.

2) 유형

3. 특성 및 진행

1) 특성 및 증상

낭포성 섬유증 환자들은 허파, 췌장과 같은 기관에 위치한 점막 생성 세포에 기본적인 결함을 가지고 있다. 낭포성 섬유증 환자들에서는 염분이 점막 생성 세포를 투과할 수 없기 때문에 두껍고 끈적거리는 점막을 생성하게 된다. 이것은 해당 장기의 기능을 방해하여, 호흡과 소화 작용을 어렵게 만든다. 두꺼운 점막은 세균에게 있어서 비옥한 서식처가 되며, 환자에게 병원균 감염이 쉽게 일어나도록 한다. 다른 증상으로는 간 질환, 당뇨병, 낮은 수정률, 공동(空洞)의 문제 등이 발생한다. 낭포성 섬유증을 가진 아이들은 또한 염분이 높은 땀을 흘리게 되며, 낭포성 섬유증을 진단하는 방법으로 이용된다.

출처 : http://www.nature.com의 science update : 1997년 09월 25일

2) 진행 및 예후

4. 원인

낭포성 섬유증은 상염색체성 열성으로 유전된다. 원인 유전자는 7번 염색체의 장완의 31.2부분(7q31.2)에 존재하는 cystic fibrosis conductance regulator(CFTR) 유전자라고 알려져 있는데, 이 유전자의 이상에 의해 CF가 발병된다고 알려져 있다. 이 유전자는 상피세포의 표면에 존재하는 나트륨과 염소 수송단백질을 만드는데, 이 유전자의 돌연변이로 인해 CF가 발병하는 것이다.

5. 치료 및 교육

1) 치료

낭포성 섬유증은 여러 기관에 영향을 줄 수 있기 때문에 이상이 있는 부분에 따라서 치료법이 달라질 수 있다. 하지만 결국에는 CFTR 유전자 및 염소 수송 단백질의 이상이기 때문에 이상이 있는 CFTR 유전자를 바이러스벡터 혹은 다른 방법을 이용하여 정상 유전자로 치환시켜주려는 유전자 치료법이 매우 활발하게 연구되고 있으며, 효소를 공급해주는 방법도 치료법으로써 연구 중이다.

Reference.

http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=mokichoi&logNo=80037675859

http://ko.wikipedia.org/wiki/%EB%82%AD%ED%8F%AC%EC%84%B1_%EC%84%AC%EC%9C%A0%EC%A6%9D

http://homi.info/learning/info/17.htm

Biochemical analysis

Acidrain — Sun, 21 Oct 2012 22:33:34 +0900

Biochemical samples

1. Large bionolecules 일반적으로 3차원 구조를 가진다.

- 수용액에서 안정성을 보인다.

- Small molecule의 경우 분리/분석에 있어서 구조적인 요인은 미미하다.

- Native protein molecule은 3,4차 구조를 가지는게 일반적이다.

2. Denaturation의 과정은 일반적으로 random coil(less folded) 이 되는 과정이다.

- 분리과정중 conformation의 변화가 발생할 수 있다.

3. Primary structure

- Biochemical macromolecule은 전형적으로 unit의 반복적인 형태이다.

- Amino acid의 결합으로 이루어진 peptide, protein이나 oligonucleotide를 이루고 있는 nucleotide을 예로 들수 있다.

3.1. Peptides & Proteins

- -NH2, -COOH작용기를 가지는 amino acid가 amide linkage(-CONH)연결로 이루어진 중합체

- 일반적으로 5000Da 을 넘는 분자량을 가진다.

- 작용기의 특성에 따라 산성 염기성 중성으로 구분될 수 있다. 좀더 구체적으로 side-chain의 pK 값에 따라 구분된다.

- 이러한 성질은 acidic group과 basic group의 점유율에 따라 달라진다.

- Proline 은 tran구조가 지배적이나 cis로 안정화되는 경향이 있다. RPC에서 분리 과정중 이러한 변화가 일어난다. 이러한 현상은 부분적 혹은 다수의 peak로 나타나기도 한다. 고온 환경하에서는 single band로 나타날수 있다.

- Cysteine잔기는 disulfide bond의 reduction으로 위와 같은 현상이 나타날수 있다.

- 중성 pH환경에서 acidic peptide는 anion exchange column에서 Rt의 변화가 cation exchange보다 크다.

- 산성하 에서의 RPC에서 acidic peptide의 Rt변화는 basic peptide보다 크다.

- RPC에서 산/염기 조건 적용 전후로 소수성 amino acid의 Rt변화가 크다. 이것은 hydrophobic 성질이 클수록 비례한다. (비극성 aromatic, aliphatic amino acid side chain이 Rt변화에 작용한다)

- 시료의 보관중에 variant의 발생 가능성이 있다. (deamination of asparagines or glutamine, oxidation of methionine, formation of cysteine disulfide bridges)

3.2 Oligonucleotides & Nucleic acids

- protein 및 peptide에 비해 denaturation의 영향이 적다.

- Intermolecular base pairing or aggregation 에 의한 다중 peak의 발생이 가능

- Formamide, urea, 고온(60도이상), high pH의 적용으로 위의 문제를 해결할수 있다.

4. Requirements

4.1 Column

- 일반적으로 smaller, non-porous particles, lower flow rate요구됨

가. pore size

- 시료보다 큰(4배 이상) pore size가 필요, pore에 들어갈수 있어야 diffusion이 일어남.

-250~350Å 크기의 packing이 50 amino acid로 구성된 peptide, 25 residue의 oligonucleotides를 분리하는데 적당하다. 이것은 특히 분자량에 대한 정보가 없을 때 잘 쓰인다.

- 100,000 Da이상의 물질은 500~4000 Å 의 packing material을 사용하기도 한다.

-Saturation capacity(Ws)는 pore diameter, sample molecule size surface area로 이루어 진다. 최대 가능한 column capacity는 surface area에 비례하지만 sample이 pore를 충분히 통과하지 못하면 capacity는 감소한다.

- Rt또한 capacity에 따라 변한다. K value는 surface area에 비례하기 때문이다. 따라서 작은 pore size -> surface area증가 -> k의 증가

나. Particle size

- Particle diameter는 column efficiency를 결정짓는 주요 요소 이다.

- 고분자에 대한 느린 확산은 wider band를 일으킨다. (1) non-porous particles of small diameter (2) flow-through or perfusive particle이 이러한 문제를 개선할 수 있다.

다. Column stability

- high pH (12이상), 고온 (50도 이상)의 조건은 bonded silica packing의 경우 bonded phase의 망실과 silica matrix가 녹는 현상을 일으킬수 있다. 이러한 이유로 bonded silica packing대신 sephadex agarose packing(carbohydrate-based packing)이나 polymeric packing(polysttrene, polymethacrylate)를 사용하기도 한다 하지만 column efficiency의 측면에서 bonded silica가 더 유리하다. 현재의 기술로 이러한 문제들은 개선이 되고 있다.

- Sol-gel silica support, endcapped alkyl bonded phase의 적용, 50mM이하의 유기 버퍼사용, 40도 미만 온도 적용이 pH 9이상의 조건에도 사용이 가능한 연구가 보고되고 있다.

4.2. Sample molecular conformation

- RPC보다 IEC HIC SEC이 protein의 native conformation을 유지하며 분리하는데 적합하다.(denaturation우려)

- denaturation이 전부 이루어 지지 않을 경우 부분적인 denaturation으로 인한 multiple band가 발생할수 있다. 고온으로 분석하는 경우 전부 denaturation이 되어 peak의 모양이 single narrow band형태가 관찰된다.

4.3. Sample recovery

- small molecule의 recovery는 실험오차를 감안하여 100%이다.

- large biomolecule은 partial denaturation 이나 irreversible attachment등으로 recovery가 달라지는 경우가 많은데 아래와 같이 개선할수 있다.

(1) 분석 시간 감소

(2) sample weight / column volume 의 비율 증가

(3) less active matrix사용 (agarose같은 친수성 material사용)

Small diameter column의 사용도 좋은 대안이 될수 있다.

4.4. Sample pretreatment

가. Sample solvent (RPC)

- 0.1~2mg/mL 의 농도

- 0.05~5% TFA in water의 초기 조건 비율이 일반적

- 6M guanidine-HCl or urea은 용해도 증가 대부분의 이동상과 용해 다수의 protein denaturation효과로 사용된다.

- 시료를 녹이는게 우선이며 유기용매의 사용이 불가피할 경우 미리 유기용매로 녹인뒤 물을 첨가 하는 방식으로 접근한다.

- 큰부피를 injection하는 경우 이동상과 sample solvent의 pH를 조정한다.

나. Surfactants

- RPC에서 SDS의 사용은 금지된다. 영구적인 컬럼 손상과 poor band shape 우려 때문

- Zwitterionic and neutral detergent(Triton X-100, X-114, Zwittergen, octylglucoside)은 SDS보다는 사용이 용이 하나 분석후 항상 column regeneration과정을 거쳐야 한다.

- IEC HIC SEC의 경우 surfactant의 사용이 가능하다.

다. Sample dissolution

- 만일 시료에 고분자 polypeptide나 protein이 있는 경우 vigorous shaking이나 mixing을 금한다.

(과도한 거품 발생 및 denaturation우려)

- 다 녹였다고 하여도 시간에 따라 침전이 발생하는 경우가 있으므로 관찰이 요구되며 원심분리나 filteration방식을 이용하는게 좋다.

라. Detection

- 잔기의 특성에 따라 흡광도의 변화가 발생한다.

(1) Purine & Pyrimidine bases (250-260nm) absorbance maxima

(2) Amide bond (210-225nm)

(3) Aromatic side chains : Phe, Tyr (254-260nm, less sensitive)

(4) Aromatic side chains : Trp, Tyr (270-290nm, less sensitive)

- Fluorescence detector의 경우 Tryptophan에 선택적으로 작용한다. (Excitation 280nm, Emission 350nm)

5. Separations of peptide and protein samples

- Resolving power의 장점으로 RPC는 peptide & protein의 분리에 이용되나 20,000Da이하의 분자에서는 refolding이 일어날 가능성이 있음에 유의 한다.

가. RP-HPLC

- Gradient elution이 자주 응용된다.

- 분리에 대한 주요 특징은 organic solvent modifier의 변화에 k가 매우 빠르게 변화

(0.1%B의 변화에 k 가 20% 변화하는 경우, 30,000Da protein)

- Method develop에서 (1) 최초 조건 선택 (2) retention 최적화 (3) 선택성 최적화 (4) column condition 선택

- 각 과정 중 관심있는 성분의 recovery를 확인한다.

나. 선호 조건 & 선택성 변화

- Peptide의 basic amino acids때문에 packing은 low-metal non acdic silica가 선호된다.

- Low pH 및 high temperature(40-80℃) 선호됨.

- Protein분리의 경우 300Å의 C3~C8 or cyano ligand적용된 컬럼 선호

- 이동상 선택에서 low pH Acetonitrile buffer gradient 추천

(1) 넓은 범위의 물질 분리

(2) Silanol의 이온화 억제(ion suppression)효과로 basic amino side chain의 silanol과의 불필요한 반응 억제

(3) Denaturation 의 완결 보조 (partial denaturation 방지)

(4) 210nm이하 에서 검출 가능하게 하여 선택성 강화

(5) Narrow peak 효과, 이동상 점도를 낮추기 때문임

(6) TFA사용하는 경우 basic amino acid의 free amino 말단기와의 ion-pairing효과로 머무름이 미약하거나 나쁜 peptide의 머무름 시간 증가효과

- 인산은 200nm에서의 검출 감도를 증가시켜 TFA의 대체제로서 활용 가능하지만 TFA의 휘발성으로 분취할 경우 TFA가 더 선호됨

- Propanol은 Acetonitrile의 대체가 가능하지만 점도가 높아 압력 문제 발생 가능.

- 0.12% TFA in water와 0.10% TFA in Acetonitrile은 gradient로 인한 baseline drift문제를 적게 만들수 있다.

- Gradient condition에서 고려할 요소는 column dementions(dead volume), flow rate, sample molecular weight, gradient steppness(%B/min)

k* = 87 F/Vm 1/S 1/%B/min

F : Flow rate

Vm: Column size

S : Sample mol.wt

- Sample molecular weight의 10배 증가는 %B가 3배 씩 줄여야 동일한 k를 얻을수 있다.

- Run time이 동일할 때 Flow rate의 3배 감소는 Gradient steepness의 3배 감소와 효과가 동일하다.

- TFA의 농도 및 컬럼 온도는 선택성에 큰 영향을 미친다.

- Low pH이동상은 basic amino acid를 protonated시켜 각 basic group에 positive charge를 발생시킨다. 또한 컬럼 표면을 negative하게 만들어 결과적으로 머무름 시간을 증가시킨다.

- Acidic peptide는 higher pH에서 머무름 시간이 증가한다. Carbonyl group의 protonation에 기인한다.

다. 일반적 문제와 해법

-역상컬럼 에서의 peptide 및 protein의 분리시 발생할수 있는 문제점은 아래와 같다.

1) wide, tailing or distorted bands

2) Low recovery

3) Ghosting

4) Multiple bands for a single compound

5) Column performance changes with time ; retention times not reproducible

1) 의 원인

- 적절하지 않은 컬럼의 사용, Acidic RPC column으로 peptide & Protein을 분리하는 경우 basic group으로 인한 silanol-interaction이 발생할 수 있다.

- Non- acidic column의 사용을 권장한다.

- 친수성 및 pore diameter로도 발생할 수 있다. C18에 강하게 결합하는 protein은 짧은 chain의 소수성 bonded phase를 적용하여 해결한다. (C3, cyano)

- Hydronamic diameter보다 약간 큰 pore size를 가진 경우 제한된 확산으로 인해 broadening이 발생할 수 있다.

1)~4) 의 결과는 denaturation에 의해서도 발생 가능하다. 분리 과정중 partial denaturation이 일어날수 있다.

Denaturation으로 인한 문제를 최소화 할 수 있는 방안은 아래와 같다.

1. Low pH condition; 0.1% TFA이 선호된다. 소수성이 큰 protein은 10~25mM의 인산을 사용한다.

2. Acetonitrile을 유기용매로 사용한다.; propanol은 소수성이 큰 protein의 경우 용이하다.

3. 컬럼 온도는 50~80℃

4. 전처리과정으로 6M urea나 guanidine hydrochloride를 사용한다. 상온에서만 가능

5. chain수를 감안하여 소수성 bonded-phase packing 사용을 고려

6. Zwitterionic detergent는 소수성 및 크가가 큰 protein의 분리에 첨가제로서 활용가능 하다. 다만 SDS은 peak shape 및 recovery의 문제를 야기 시킬수 있다.

- Proline isomerization은 많은 peptide에서 관찰되는 현상이며 이로 인한 peak shape문제 (splitting, overlapping peak)발생 가능하다. 컬럼 온도 상승으로 개선 가능.

- Polymeric packing and polymer-coated silica, alumina, zirconia column은 pH의 변화에 안정한 특징이 있지만 efficiency가 상대적으로 떨어져 분취용 이나 분리 초기에 활용가능하다. analytical사용시에는 alkyl-silica packing을 활용한다.

- 중간 및 높은 pH에서 안정적인 컬럼 사용은 낮은 온도에서의 분리, lower ionic strength mobile phase, organic or borate buffer를 사용한다.

6. Ion-exchange HPLC

- Protein의 분리에 있어서 bioactive form을 유지하면서 분리하기 위해서는 IEC의 적용이 유리하다.

- Cation exchange에서 Mobile phase pH가 감소할수록 retention이 증가한다. 이것은 고정상의 negative charge증가로 인해 solute의 증가된 positive charge와 더 강하게 결합하기 때문이다.

- Anion exchange은 위의 경우와 반대의 양상을 보인다.

- pH가 등전점과 일치하는 경우 Retention은 양이온 교환 혹은 음이온 교환 chromatography중 하나에서 최소화 된다. 고분자 protein의 경우 일정 side에서 불균형 전하를 띠는 경우가 있어 이 경우 머무름이 증가하는 경우도 있다.

- pH 3.0에서 –COOH group은 비이온화 된다. 반면에 basic residue 부분은 protonated되어 전체적으로 양전하를 띠게 된다. 따라서 대부분의 peptide 및 protein은 pH 3.0에서 양전하를 띠게 되어 cation exchange에서의 salt gradient조건에서 분리가 가능하다. Small peptide의 cation exchange분리시 처음에 pH 3.0조건이 추천되는 이유가 이것이다 하지만 denaturation의 가능성이 있기 때문에 실제 빈용되지는 않는다.

- IEC를 이용한 peptide & protein의 분리는 단독 보다는 RPC와 병용으로 사용한다. IEC의 column capacity가 더 크기 때문이다. 따라서 최초 분리는IEC로 진행하고 이것을 바로 RPC로 연결하여 주입하는 방식이 일반적이다.

가. 분리 시작에 있어 선호되는 조건

- AEC, CEC중 하나를 선택하고 안되는 경우 다른 방식을 선택한다.

1) Salt

- NaCl은 220nm같이 낮은 파장에서도 사용이 가능하지만 pH<5인 경우 매일 기기세척을 시행하여 부식을 방지해야 한다.

- Sodium acetate는 부식의 우려는 없지만 230이상에서 검출 한계 및 감도 저하가 있다.

- Sodium sulfate나 phosphate는 투명하고 부식성이 없다.

2) Organic solvent

- A or B solvent에 유기용매를 첨가할수 있다. 소수성 column packing을 사용하는 경우 시료의 응집현상이 일어나 peak broadening 및 distortion이 일어날 수 있다. 10%정도의 methanol 이나 Acetonitrile을 첨가하면 이런 문제를 해결할 수 있다.

- 유기용매의 비율이 높으면 활성 저하의 우려가 있으나 membrane-bound protein, histone 및 다른 재조합단백질은 70% 미만의 유기용매 비율에서 안정하다.

나. Changing selectivity

- IEC를 이용한 단백질의 분리, 분석에서는 RPC와 달리 gradient steepness 및 온도의 변화가 band spacing에 큰 영향을 미치진 않는다. pH가 더 중요 요인으로 작용한다.

다. 일반적인 문제점 및 해결

- 소수성 단백질과 polypeptide의 IEC분리에 있어 recovery가 문제 될 수 있다.

- Gradient 진행 중 Salt의 농도가 높아지면 ion exchange retention이 감소하나 소수성 retention이 강해져 protein의 머무름은 처음에 감소하나 나중에 증가한다. (peak tailing 및 poor recovery) Hydrophilic IEC packing + 20% acetonitrile을 사용하여 개선 가능하다. 이것은 acetate 및 chloride를 사용하여 소수성 머무름 현상이 일어날 때도 적용가능하다.

Reference

1. http://schoolworkhelper.net/protein-structures-primary-secondary-tertiary-quaternary/

2. Practical HPLC method development 2nd edition (Lloyd et al.)

GPCR protein

Acidrain — Sun, 15 Jul 2012 19:29:55 +0900

G 단백질 연결 수용체 (G protein-coupled receptor, GPCR)는 세포막에 존재하는 단백질 중 가장 큰 대가족(superfamily) 수용체 군으로 세포 바깥으로부터 오는 신호를 세 포 안으로 전달시켜주는 역할을 한다. 인간 유전체에는 현재까지 약 800여종의 GPCR 유전자가 존재하는 것으로 알려지고 있다. GPCR은 인간의 몸 안팎에 존재하는 다양한 리간드 (ligand)의 표적 단백질로, 크게 후각 및 미각 자극에 반응하는 감각 수용체 그룹 (olfactory/gustatory GPCR)과 신경전달물질, 호르몬 등 각종 신호전달물질에 반응하는 수용체 그룹 (transmitter GPCR)으로 분류할 수 있다.

인간 유전체에는 약 367종의 transmitter GPCR이 발견되고 있으며, 이들은 인간의 생식, 대사, 면역, 운동, 소화, 호흡, 순환,수면, 심리작용 등 대부분의 생리적 기능 조절에 중요한 역할을 수행한다. GPCR 작용 리간드는 다양한 질병․질환과 관계되어 있어 GPCR은 제약 시장에서 가장 주목받는 약물작용점으로 여겨지고 있다. Transmitter GPCR 중 그 리간드와 기능이 밝혀지지 않은 것들을 고아 GPCR (orphanGPCR, oGPCR)이라 하며, 이들의 리간드를 찾는 deorphanization 연구는 신약개발의 핵심적인 위치에 있다.

>> 활성

GPCR에 작용 리간드가 결합하면 수용체 구조의 변화가 일어나고, 이러한 변화는 G 단백질의 활성을 유도한다[16]. G-단백질은 α subunit과 βγ subunit 복합체로 구성된다. α subunit에는 GDP가 결합되어 있는데, GPCR이 활성화되면 GDP가 분리되고 그 자리에 GTP가 붙는다. 이러한 과정은 βγ subunit과 α subunit의 분리를 수반한다.

분리된 subunit들은 각각 하위단계 효소나 이온채널에 작동한다. Gα subunit의 GTPase 활성에 의해 Gα-GTP가 Gα-GDP 형태로 바뀌게 되면서 신호전달은 정지된다. Gα-GDP는 다시 βγ subunit 재결합하게 된다. 이러한 일련의 과정은 GPCR 활성화 뒤 수초 이내에 일어난다.

GPCR 리간드는 그 기능에 따라 agonist, inverse agonist, antagonist로 분류할 수 있다. GPCR는 리간드 결합과
관계없이 활성화 상태와 비활성화 상태를 오가는 평형상태를 유지하고 있다. Agonist는 수용체의 활성화 비율을 높여 생물학적 반응을 유도한다. Inverse agonist는 반대로 수용체의 활성화 비율을 낮춘다. 즉 수용체의 기저활동 (basal activity) 수준을 감소시킨다. Antagonist는 agonist나 inverseagonist의 기능을 억제한다. Inverse agonist의 경우 기저활동이 낮은 수용체에 대해서는 최소화된 역할을 하며,단지 이 수용체가 agonist에 의해 활성화 된 경우에만 효과를 발휘하게 된다. 따라서 이 경우 이 작용제가 inverse agonist인지 antagonist인지 구별하기 힘들다. 하지만 기저활동이 높은 수용체에 대해서는 inverse agonist의 기능이 antagonist와는 확연히 구별된다.

따라서 지금까지 antago-nist로 분류되었던 약물들이 실제로는 inverse agonist일 가능성이 높으며 antagonist의 엄밀한 정의는 agonist, 혹은inverse agonist의 작용을 억제하지만 수용체의 기저활동의증감에 영향을 주지 않는 약물을 의미한다.

GPCR의 작용 리간드는 orthosteric하게 혹은 allosteric하게 수용체에 결합한다. 대부분의 작용 리간드는 내재적인
(endogenous) 리간드가 결합하는 부위에 결합하며 이를 orthosteric 결합이라 한다. 반면 작용 리간드가 다른 위치에 결합하면 이를 allosteric 결합이라 한다. 이때 작용 리간드 를 allosteric modulator라 한다. 이들은 비록 내재적 리간드가 결합하는 곳과는 다른 위치에 결합하지만, 내재적 리간 드와 수용체의 결합, 수용체 활성에 간접적으로 영향을 줄 수 있다.

>> 중요성

GPCR은 인체의 대부분의 생리적 활동에 관여하며 다양한 질병․질환과 관련되어 있다. 판매수익 200위 안에
25%의 약물이 GPCR을 작용점으로 하고 있으며 이들은 연간 270억불의 매출을 보인다 . 이들 약물은 심
혈관질환, 소화기관질환, 중추신경계질환을 포함한 다양한 질병 질환․치료에 사용된다. 예를 들어 비중추신경계 질환 으로 Zantac (ranitidine)이 β2-adrenergic 수용체를 통한 궤양치료, Cozaar (Losartan)은 안지오텐신 (angiotensin) 수용체를 경유하여 고혈압치료, Claritin (loratadine)은 Histamin 수용체를 경유하여 알레르기 치료, Lupron (leuprolide)는 GnRH 수용체를 경유하여 전립선암 치료에 사용된다. 중추신경계 질환에는 Zyprexa (Olnazapine), Risperdal (Risperidone) 이 세로토닌 (5-HT) 수용체를 경유하여 정신분열증치료, Neurontin (Gabapentin)은 GABA 수용체를 경유하여 간질 및 통증 치료에 사용된다.

GPCR은 다양한 질병․질환에 관여하기인간유전체사업 결과 transmitter GPCR로 예상되면서 그 리간드가 밝혀지지 않은 GPCR이 150여 종이 있음이 밝혀졌고 이를 고아 GPCR (orphan GPCR, oGPCR)이라 한다.

oGPCR의 리간드를 찾아내는 것은 신규 생리 활성물질을 발굴하는 것이며, 이들은 신약 개발의 주요 표적이
된다. 지난 10여년 간의 연구결과 약 50여종의 oGPCR에대한 리간드가 밝혀지고 (Table 1), 현재 약 100여종의 진성
oGPCR들이 남아 있다. oGPCR에 대한 리간드 발굴연구는 역약리학 (reverse pharmacology)적 방법의 개선을 가져 왔다. 기존의 전형적인 약물개발 방법은 질병․질환을 선택하고 그 병리생리적 기전을 이해하여 이를 표적으로 약물을 개발하는 forward pharmacology 방법이다. 이러한 방법을 통해 결과적으로 그 약물이 GPCR을 표적으로 함이 밝혀지게 된다. 반면 역약리학적 방법은 그 리간드와 기능을 모르 는 GPCR의 리간드를 먼저 발굴하고, 이들의 기능을 역추적하여 어떠한 질병․질환에 연관되는 지를 찾는 것이다.

때문에 많은 제약회사들이 표적 GPCR에 대한 특성을 분석하고 이들의 활성을 조절할 수 있는 신규물질 개발에 투자하고 있다. 현재까지 약 400종의 GPCR이 약물의 작용점이 될 수 있음이 예견되고 있다. 또한 GPCR리간드는 주로 작은 분자로 이루어져 있어 구강투여가 가능하거나 약물 선택성을 높일 수 있는 리간드 변형이 용이하다는 장점을 가지고 있다. 최근에는 로돕신 삼차구조에 근거한 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 리간드-수용체간의 분자적 상호작용을 계산할 수 있어 보다 효과적으로 약물을 개발할 수 있다.

GCPR_내분비외과.pdf

Ref.

http://shop.perkinelmer.ca/fr-CA/FocusAreas/Mkt+Life+Science+Research/GPCRResearch.htm

G 단백질 연결 수용체 (GPCR)의 생리활성 기전 및 고아 GPCR 연구 동향/ 대한내분비학회지: 제 20 권 제 3 호 2005, 오 다 영․성 재 영

의학 통계 분석 방법

Acidrain — Sun, 1 Jul 2012 20:45:24 +0900

의학 통계 분석 Case 별 분류

Ref.

1. 권역심뇌혈관질홖센터직무능력강화를위핚통계강좌(초급1), 경북대학교병원 대구경북권역심뇌혈관질환센터예방관리센터신지연

Apoptosis

Acidrain — Sun, 17 Jun 2012 14:42:50 +0900

I. Introduction (Reference 참조)

모든 세포는 살아가는 시간이 있음과 동시에 죽어야 되는 시간을 가지고 있다. 세포가 죽는 방법은 두 가지가 있다.

- 위험한 물질에 의해 죽는 것(Death by injury)
- 자살하도록 유도되는 것.(Death by suicide)

1. Death by injury

기계적인 손상이나 독성 화학물질에 노출되는 경우에 세포들은 죽을 수 있다. 이러한 경우에 세포들은 세포막의 물질투과성 통제력을 잃기 때문에 팽창하게 되고 세포 내용물이 빠져 나오며 유출된 내용물은 주변의 다른 조직을 감염시키게 된다.

2. Death by suicide

자살이 유도된 세포들은 다음의 과정을 보여준다.

- 움추려 든다.
- 미토콘드리아가 시토크롬C를 방출하고 분해된다.
- 세포 표면에 거품같은 수포를 형성한다.
- 핵이 분해된다.
- 작고 막으로 둘러싸인 조각으로 쪼개진다.
- 정상적일 때 세포막안에 숨겨져 있는 인지질인 포스파티딜세린인 표면에 노출된다.
- 대식세포 등과 같은 식세포의 표면에 있는 수용기가 이 조각들을 감지하여 삼키게 된다.
- 식세포들은 또 다른 감염을 방지하기 위하여 시토카인을 분비한다.

PCD는 유사분열처럼 세포들에게 본질적으로 존재한다.

(1) 왜 세포는 자살을 해야만 하는가?

두 가지 이유가 존재한다.

가. PCD는 유사분열처럼 정상적인 발달과정에서 필요하다.

예를 들면

- 올챙이가 개구리로 변대하는 과정에서 꼬리의 재흡수과정
- 태아의 손과 발에서 손가락과 발까락이 생길 때 사이에 있는 조직이 제거되는 과정
- 월경시작시 자궁 내벽이 떨어져 나가는 과정
- 뇌속에 존재하는 뉴런사이의 적절한 연결(시냅스)이 형성될 때 여분의 세포가 제거되는 과정

나. 개체에 위협을 가하는 세포들을 파괴할 때 필요하다.

예를 들면

- 세포가 바이러스에 감염되었을 때

cytotoxic T림프구(CTL)가 바이러스에 감염된세포를 죽이는 방법중에 하나가 자살을 유도하는 것이다.

- 면역계의 세포

세포매게 면역반응이 일어나면서 활성화된 세포들은 반응이 끝나고 나면 신체구성물질을 공격하지 못하도록 신속하게 제거되어야 한다. 이 일도 CTL이 유도하고 있는데 이러한 자살기작이 결핍되는 경우 자가면역증이 유발되기도 한다.

- DNA가 손상된 세포

게놈이 손상된 세포들은 탄생시 결손을 보여주거나 암으로 전이될 수 있다. DNA가 손상되게 되면 그 세포는 p53이라는 물질을 생산하는데 이 물질은 자살 유도체이다. 몇몇 암세포에서 p53 유전자의 돌연변이가 발견되었다.

- 암세포

암치료에서 사용되는 방사선과 화학약품이 어떤 종류의 암세포의 자살을 유도한다.

3. 무엇이 세포들로 하여금 자살하게 하는가?

계속 생존케하는 양의 신호(positive)를 거부하거나 죽게하는 음의 신호(negative)를 받아들임으로써 세포는 자살을 개시하게 된다.

(1) 양의 신호 거부

대부분의 세포가 계속 살기 위해서는 다른 세포들로부터 지속적인 자극을 받아들여야 한다. 이러한 신호에는 뉴런을 위한 성장인자와 림프구의 유사분열을 위한 필수 인자인 인터루킨-2 등이 있다.

(2) 음의 신호 수용

세포내에 산화물이 증가하는 경우와 이들 산화물과 자외선, X선, 화학치료약 과 같은 물질에 의한 DNA손상이 있을 때 발생되는 신호로 세포의 특수한 수용기에 결합하여 세포가 자살하도록 만들어 준다. 이러한 죽음의 활성인자에는 종양괴사인자(TNF인자; Tumor necrosis factor), 림포톡신(TNF의 일종), Fas ligand가 있다. 이 Fas ligand(FasL)는 Fas(혹은 CD95라 부르기도 함)에 결합한다.

4. 자살의 기작

2가지 기작이 존재한다.

- 세포내부에서 만들어진 신호에 의한 방법
- 세포수용기에 결합한 죽음활성자에 의한 방법. 죽음 활성장에 TNF, 림포톡신, FasL 등이 있다.

(1) 세포내부에서 만들어진 신호에 의한 방법

건강한 세포에서 미토콘드리아 외막에는 Bcl-2 단백질이 존재하고 있다. 이 단백질이 Apaf-1 단백질과 결합을 하고 있는데 세포내부에서의 손상으로 이들의 결합이 깨어지게 되면서 구조가 부실해져 미토콘드리아로부터 시토크롬C가 빠져나오게 된다. 떨어져 나온 시토크롬C와 Apaf-1은 세포질에 있는 카스파제9와 결합하게 된다. 이들 복합체(시토크롬C+Apaf-1+카스파제9+ATP)를 apoptosome이라고 한다. 이 아폽토솜이 세포질에 쌓이게 된다.

카스파제9는 12개 넘는 카스파제 중 하나이다. 이들은 모두 프로테아제로 아스파르산 잔기를 끊는 기능을 가지고 있다. 카스파제9는 다른 카스파제를 활성화시켜준다. 결국 계속되는 활성화로 이들의 단백질 분해 활성은 매우 크게 증가하게 되어 세포질의 구조단백질의 분해가 일어나고 염색체의 분해가 일어나게 된다. 그 후 다른 세포에 의한 식세포 작용으로 마감되게 된다.

(2) 세포수용기에 결합한 죽음활성자에 의한 방법

Fas와 TNF 수용기는 세포 표면에 존재하는 내재성 단백질들이다. 이들은 죽음의 활성인자와 결합하여 신호를 세포질로 전달하여 카스파제8의 활성을 유도한다. 이 카스파제8도 9처럼 세포의 식세포 과정을 촉진시켜 준다.

예를 들어 cytotoxic T세포가 그들의 목표물을 인식하게 되면 이들은 더 많은 FasL을 표면에 뿌리게 되어 목표세포의 Fas수용체에 결합하여 세포 자살이 일어나게 된다.

참조 :

Growth factor signaling (epidermal growth factor)

Prostaglandin production (COX-2)

Inflammation (inflammatory cytokines/ NF-kB, TNF, IL-1, IL-6, chemokines)

Drug resistance gene products

Cell cycle proteins (Cyclin D1, Cyclin E)

Angiogenesis (vascular endothelial growth factor)

Invasion (Matrix metalloproteinase)

Antiapoptosis (Bcl-2,bcl-X/L, XIAP, survivin, FLIP)

Cellular proliferation (c-myc, AP-1,growth factors)

II. 관련 assay

1. LDH-release assay

Lactate dehydrogenase (LDH) is a soluble cytosolic enzyme that is released into the culture medium following loss of membrane integrity resulting from either apoptosis or necrosis. LDH activity, therefore, can be used as an indicator of cell membrane integrity and serves as a general means to assess cytotoxicity resulting from chemical compounds or environmental toxic factors.

세포에서 방출한 젖산 탈수소효소 (Lactose dehydrogenase : LDH)를 고감도로 측정하므로써 세포손상을 측정하며, kit로 나와있다.

LDH는 세포질에 존재하는 효소로 통상은 세포막을 통과하지 않으나 세포막이 손상되면 세포 외부 즉 배지 중으로 방출된다. 본 키트를 사용하므로써 방출된 LDH를 다음과 같은 원리로 측정할 수 있다. LDH는 젖산의 탈수소화를 촉매 작용해 pyruvate와 NADH를 생성한다. 이 NADH는 diapholase의 촉매에 의해 테트라졸리움염 (INT)을 환원시켜 490 nm의 흡수를 갖는 적색의 formazan 색소를 형성한다. 따라서, LDH 활성을 490 nm의 흡광도의 증대로 측정할 수 있다.

2. Caspase assay

Caspase-3, -9등에 의해 절단되는 DEVD-pNA(-3), LEHD(-9)은 강한 형광을 나타내는 기질이다. 이것을 측정한다. kit로 나와있다.

3. Flow cytometry

유액(流液)상태의입자(Particle) 나세포(Cell) 가일정감지지역(sensing area)를통과할때각각의입자나세포가갖는여러특징을동시에측정하는방법.

프로그램에 따라 다양한 실험 응용이 가능하다. Cell cycle analysis에서 sub-G1 peak은 apoptotic portion을 갖는다고 알려져 있다.

그 이유는 Apoptosis가 일어나는 동안에는 calcium-and magnesium-dependent nuclease들이 activation 되면 서 DNA를 절단하게 된다. 그것으로 인해 잘려진 작은 DNA절편들은 실험과정 중 PBS와 같은 washing buffer에 녹아 나와 washing 단계에서 제거되게 된다. 그러므로 apoptosis가 일어난 세포를 정량적인 DNA-binding dye인 PI를 사용하여 염색해 보면 apoptosis에 의한 DNA fragmentation 현상에 의해 세포내에 존재하는 DNA양이 줄어들어 덜 염색되고 세포주기의 G1 peak 왼쪽에 sub-G1 peak를 형성하게 된다.

4. Capillary tube formation assay

**HUVEC Cell(혈관내피세포)**------------------------------------------------------------------------------------

HUVEC are isolated from the vein of the umbilical cord and are commonly used for physiological and pharmacological investigations, such as macromolecule transport, blood coagulation, angio- genesis, and fibrinolysis.

PromoCell offers HUVEC from single donors or pooled from up to four different donors. (Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAEC) from the same donor are available on request). In addition, HUVEC are available which are pre-screened for angiogenesis and other VEGF (vascular endothelial growth factor) dependent signaling studies.

They have been positively tested for VEGF response using PromoCell´s unique 3D-Angiogenesis Assay. VEGF is an important signaling protein involved in both vasculogenesis and angiogenesis. In vitro, VEGF has been shown to stimulate endothelial cell mitogenesis, cell migration, sprouting, and microvascular permeability.

---------------------------------------------------------------------------------------------------

The assay measures the ability of endothelial cells, plated at subconfluent densities with the appropriate extracellular matrix support, to form capillary-like structures (a.k.a tubes). Scientists typically employ this assay to determine the ability of various compounds to promote or inhibit tube formation. Compounds that are able to inhibit tube formation could be useful in various diseases, such as cancer, where tumors stimulate new blood vessel formation to receive oxygen and nutrients in order to grow beyond a relatively small size.

Upon plating, endothelial cells attach and generate mechanical forces on the surrounding extracellular support matrix to create tracks or guidance pathways that facilitate cellular migration. The resulting cords of cells will eventually form hollow lumens

The advantages of this assay are that it is relatively easy to set up, requires a short culture period, is quantifiable, and is amenable to high-throughput analysis. A disadvantage of this assay is the large variation of tube-forming capability among different lots of endothelial cells and support matrices, which makes the selection of these resources crucial to obtaining consistent and reliable data. While this assay is essential, users are cautioned that results should be confirmed in vivo because commercially available endothelial cells have been pre-selected for their proliferative capacity and there are no heterospecific cell interactions being represented. It has also been reported in the literature that certain non-endothelial cell types demonstrate tube formation, which suggests that tube formation by endothelial cells may not represent true differentiation of this cell type.

Ref.

http://kimwootae.com.ne.kr/generalbiology/apoptosis.htm

https://www.qiagen.com/geneglobe/pathwayview.aspx?pathwayID=99

http://www.caymanchem.com/app/template/Product.vm/catalog/10008882

http://www.kmle.co.kr/search.php?Search=LDH

http://www.promocell.com/products/human-primary-cells/endothelial-cells-large-vessels/human-umbilical-vein-endothelial-cells-huvec/

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/Angiogenesis-Protocols/endothelial-cell-tube-formation-assay.html

http://www.ksabc.or.kr/admin/contribute/journal/kpaper/2006_49_4_270.pdf

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21130827

Mitogen

Acidrain — Sat, 16 Jun 2012 21:12:40 +0900

Initiation : Concanavalin A 관련 정보

유사분열 유도 물질

A mitogen is a chemical substance that encourages a cell to commence cell division, triggering mitosis. A mitogen is usually some form of a protein.

Mitogenesis is the induction (triggering) of mitosis, typically via a mitogen.

Mitogens trigger signal transduction pathways in which mitogen-activated protein kinase (MAPK) is involved, leading to mitosis.

Concanavalin A (ConA)

is a lectin (carbohydrate-binding protein) originally extracted from the jack-bean, Canavalia ensiformis. It is a member of the legume lectin family. It binds specifically to certain structures found in various sugars, glycoproteins, and glycolipids, mainly internal and nonreducing terminal α-D-mannosyl and α-D-glucosyl groups.^[2]^[3] ConA is a plant mitogen, and is known for its ability to stimulate mouse T-cell subsets giving rise to four functionally distinct T cell populations, including precursors to suppressor T-cell;^[4] one subset of human suppressor T-cells as well is sensitive to ConA.^[4] ConA was the first lectin to be available on a commercial basis, and is widely used in biology and biochemistry to characterize glycoproteins and other sugar-containing entities on the surface of various cells.^[5] It is also used to purify glycosylated macromolecules in lectin affinity chromatography,^[6] as well as to study immune regulation by various immune cells.^[4]

유사분열(Mitosis)

엄밀히 말하면 유사분열은 유전정보를 가지고 있는 구조인 염색체의 복제와 분배과정을 말한다.

LPS

그람음성균의 대표적인 면역 활성 요소인 lipopolysaccharide(LPS)는 세포 표면을 구성하는 물질로서 병원성 세균과 진핵생물간의상호작용에 아주 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 LPS는 동물과 인간 뿐 아니라 초파리나 식물에 이르기까지 방어기전을 연구하기 위하여 사용되어지는 중요한 물질이
다.

LPS 연구에서 찾아볼 수 있는 재미있는 이론 중 하나는 LPS가 세균 자신의 보호를 위하여 사용되어진다는 것인데 독성 물질이 세균 내부로 들어오는 것을 차단함으로써 자신의생명을 지킨다는 것이다. 동물모델이나 인간에서 LPS로 인한 패혈증의 발생 기전은 잘 알려져 있는데 LPS는 lipid A와 여러 다당류로 구성되어 극미량으로도 강력한 면역활성을 유도하며, 체내에서 LPS-binding protein (LBP) 및 CD14 수용체와 결합한 후 toll-likereceptor (TLR)4를 활성화시켜 interferon (IFN)-β를 생성한다 (Yun 등, 2006). IFN-β는 세포수용체와 결합하여 STAT1을 인산화시키고, inducible nitric oxide synthase (iNOS)의 생
산을 유도하여 결국 nitric oxide (NO)를 생성하여 혈관세포의 myosin phosphatase와potassium channel을 활성화시킴으로써 혈관을 확장시킨다.

NO 발생 억제제 투여 시 패혈증이 감소되고, iNOS가 결핍된 생쥐는 LPS를 주입해도 쇼크가 잘 오지 않는 것으로 보아NO는 패혈증 쇼크와 밀접한 연관이 있음을 나타내고, 패혈증의 발생 원인으로 생각된다
(Han 등, 2006).

그람양성균은 LPS가 없으며 주요 패혈증 원인임에도 불구하고 그 발생기전이 밝혀지지않았는데 그람양성균 세포벽 성분으로 LPS처럼 fatty acid로 구성된 lipid 부분과 여러 다당류가 포함된 lipoteichoic acid (LTA)가 오래전부터 패혈성 쇼크의 유발물질로 알려져 왔다.
그러나 그람양성균 패혈증의 대부분을 차지하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과폐렴쌍구균 (Streptococcus pneumoniae)에서 LTA에 대한 면역반응 연구가 전 세계 연구자들끼리 일치하지 않아 그람양성균에 의한 패혈성 쇼크(septic shock)의 기전은 큰 논쟁거리로 남아있는 상황이다. 이처럼 그람양성균에 의한 패혈증 쇼크의 연구에서 결과가 일치하지 않고 많은 발전을 하지 못했던 이유는 순도 높고 완전한 구조를 갖는 LTA를 확보할 수없었기 때문이다. 최근 연구결과에 따르면 대부분의 연구자들이 구입하여 사용한 Sigma 제품의 S. aureus의 LTA는 보통 50여 개에 이르는 반복성 구조내의 D-alanine 잔기도 대부분 훼손되어 면역반응에서 많은 차이를 나타낸 것이 확인되었다 (표 1, Morath 등, 2002).

^Ref.

^WIkipedia

http://www.cellsignal.com/reference/pathway/MAPK_Cascades.html

http://www.kormb.or.kr/home/kor/bioin/file/vcontents297_%B9%DA%C5%D7%B8%AE%BE%C6%20%BC%BC%C6%F7%BA%AE%B0%FA%20%BB%FD%B7%CE%BA%B4%BB%E7%C0%C7%20%BA%F1%B9%D0.pdf

TRIZ 교육 후기

Acidrain — Sat, 16 Jun 2012 19:56:27 +0900

사내 교육으로 TRIZ 강좌를 2일간 걸쳐서 들었다. 예전에 읽었던 책 내용중 TRIZ에 관한 이야기를 재미있게 본 기억이 나서 좀 더 구체화 시켜 보고자 신청하였고 매우 만족스런 강의였다.

최근 공부하고 있는 DOE에 대해 예상외로 강조하시고 핵심을 잘 짚어 주어 본인이 방향을 잘못잡고 있지는 않다는 확신이 들었다. 40가지 문제해결이론은 말씀하신것 처럼 구구단처럼 외워 보고 적용해 봐야겠다.

사실 강의의 주 내용인 TRIZ도 좋았지만... 중간중간 회사생활과 개인에 대한 여러 이야기들, 분위기 환기용 이겠지만 개인적으로 크게 와 닿았던 말들이었다.

최근에 나름 고난의 행군 중이라 심신이 피로했는데 덕분에 멘탈정화(?)에 많은 도움이 되었다고 생각한다. 지면을 빌어 강사님께 고마움을 전합니다.

TRIZ 서적을 찾다가 우연히 강사님 인터뷰 글이 있어 한번 올려봅니다. 강의를 들으며 개성있으시고 일과 삶의 균형을 잘 맞추고 있다고 느꼈는데 인터뷰 내용도 그러한 모습이 뚝뚝 묻어나네요.

생각과 행동과 삶에 창의성 발휘하기

[생각의 창의성]의 작가, 신소재 91학번 김효준 선배님을 만나다

Interviewer: 산경 99 김혜리

1. 선배님 안녕하세요. 선배님 약력을 간단히 소개 부탁드립니다.

91학번으로 재료공학과에 입학을 했습니다. 학부과정을 1년 더 다녀서 5년을 지내고, 곧 바로 취업을 했지요. 삼성항공에 공채 37기로 입사시험을 통과했는데, 신입사원 교육 마치고 난 후, 회사에서 실수로 사람을 너무 많이 뽑았다고 하여 삼성종합기술원으로 발령이 났습니다. 1997년 3월부터 2008년 2월까지 삼성종합기술원에서 연구원과 staff으로 일을 했고, 2008년 5월부터 독립하여 프리랜서로 일하고 있습니다.

2. 2004년에 "생각의 창의성 TRIZ"라는 책을 집필하셨고, 2008년 현재까지도 교보문고 베스트셀러에 이름을 올려서 스테디셀러로 자리매김했습니다. 어떻게 책을 쓰게 되셨는지, 책을 쓴다는 것은 선배님께 어떤 의미가 있었는지, 독자들의 의견은 어땠는지, 관련된 에피소드는 어떤 것이 있었는지 궁금합니다.

교보문고 베스트셀러 그리고 스테디셀러가 맞긴 하지만, 분야가 자연과학분야라서 딱히 자랑할만한 것이 못됩니다. 한 달에 300권만 팔려도 자연과학분야에서는 베스트셀러라고 하더군요. 그래도 5년 이상 꾸준히 매달300권 이상 팔려나가는 것이 신기하다고 생각했는지, 교보문고의 담당자가 책 한 권을 보내달라고 하기에 사서 보라고 했지요^^. 제가 회사에 다닐 때 하던 일이 트리즈(TRIZ)입니다. “창의적 문제해결 이론”의 약자(Theory of Inventive Problem Solving)인데 러시아어의 약자라서 TRIZ입니다. 배운다고 창의적이 될 것인가라는 고민은 하겠지만, 일단 무엇인지 살펴본다면 꽤 나쁘지 않은 이론적 토대를 제공한다는 것을 알 수 있을 것이라고 생각합니다. 트리즈라는 업무를 5년 정도 하게 되니까, 저절로 책 한 권을 쓸 수 있는 지식이 쌓였던 것 같습니다. 또한 누구보다도 먼저 트리즈를 접하게 되었다는 것이 중요했고, 무엇보다도 집사람의 도움이 컸다고 볼 수 있습니다. 제가 91학번인데, 그 당시만 해도 국내 기술서적, 예를 들어 열역학의 국내 서적은 빨간 하드커버에 보리종이로 아주 열악했고, 언제간 기술분야에서 제대로 된 책을 만들어 프렌틱스홀, 위즐리앤와이즈 와 같은 세계적 출판사 책과 견주어 보겠다는 것이 꿈이었는데, 이 번에 소원 하나 풀었던 거라고 생각합니다. 나름대로 종이 두께부터 시작해 책과 관련된 모든 품질관련 인자들에 대해서 수준을 조정해서 고급스런 기술서적을 계획했는데, 출판사에서 거절을 당했습니다. 그렇게 고급스럽게 만들면 책 값은 38000원이 넘어가고 그렇게 되면 아무도 책을 사지 않으니, 품질을 떨어뜨리라는 것이지요. 그래서 그냥 집에서 만들었습니다. 마침 아내가 디자인의 전문가라서 아내 이름으로 출판사 사업자등록 내고, 인쇄소에는 파일을 전송했고, 책은 유통회사에 보관하면서 주문 들어오면 배송하고 있습니다. 물론, 인쇄는 없습니다. 사장님께서 모두 챙겨가시지요^^.

책이라는 것은 명예인 것 같습니다. 자연스런 자신의 홍보가 된다는 면에서 자신의 이력에 큰 점을 찍는 것 같습니다. 거창하게 말하자면 자신은 시간이 지나도 사라지지만 책은 계속 팔리고 있을 것이라는 생각은 참 뿌듯하게 만듭니다. 또한 회사를 다니다 독립해서 프리랜서를 하게 되면서 홍보의 중요성을 느끼게 되는데 책보다 큰 홍보가 있을까 생각됩니다. 아무리 물건이 좋고 실력이 좋으면 뭐하겠습니까? 알아야 사 주고 불러주지 않겠습니까?

생각의 창의성은 2004년도에 출간했습니다. 트리즈를 시작한 지 5년 되던 시점이었고, 결혼한지는 8개월 된 시점이었습니다. 신혼 생활을 책 제작과 함께 한 것 같습니다. 당시 책에는 트리즈에 관련된 대부분의 사항들이 빠짐없이 정리되어 있었고, 단순한 나열이 아닌, 트리즈에 대한 체계적 논리로 전개되어 있었습니다. 트리즈가 너무 어렵다고 느끼던 사람들은 이 책이 너무 쉽게 써졌다고 평가해 주고, 너무 쉽게 트리즈를 기대했던 분들은 이 책이 너무 전문적이다라고 평가해 주시더군요. 쉽다는 평가와 어렵다는 평가가 공존하는 것으로 볼 때 나름대로 난이도 조절은 성공했다고 봅니다.

사실 책의 내용면에서는 전문가가 전문가적 지식을 쏟아 붓는다면 어느 책이던 우열을 가리기가 어렵고 또한 나 혼자만의 만족일 수 밖에 없을 겁니다. 그런데 2005년 수학능력시험을 위한 교육부주최 수능모의고사에서 저의 책의 전반적인 내용이 지문으로 사용되었는데, 그 때 제일 뿌듯했습니다. 가장 보람 있었던 순간이지요. 그 덕분에 책이 많이 팔린 것은 아니었습니다. 어차피 그 책은 필요한 사람만이 사는 책이니까요? 바램이 있다면, 앞으로도 꾸준히 사람들의 손을 거쳐서, 대한민국의 모든 엔지니어의 책상 위에 한 권씩 꽂히기를 기대합니다. 그런 목적에서 책을 만들었고 편집했으니까요.

3. 선배님의 이력을 좀더 상세히 알기 위해서는 TRIZ에 대한 설명이 좀더 필요할 것 같습니다. 설명을 좀더 부탁드립니다. TRIZ가 기업이나 개인에게 어떤 결과를 가져올 수 있는지, 실제적인 예시를 들어주면 이해하기가 쉬울 것 같습니다.

쉽게 이야기 하자니, 피상을 전할 것 같고, 어렵게 이야기 하자니 인터뷰에 어울리지 않을 것 같습니다. 그래서 트리즈가 인기가 없는 것인지 모르겠네요. 쉽게 해도 안되고 어렵게 해도 안되니, 공간으로 분리를 하는 것이 어떨까요? 트리즈를 간결히 설명하는 5페이지의 워드 파일을 드리지요.

4. 박사가 반 이상인 삼성종합기술원에 학부 출신으로 입사하셔서도 실력을 인정받으면서 일하셨다고 들었습니다. 삼성에서는 어떤 일을 하셨는지요? 특별한 업무철칙이 있으셨나요?

당시 1000여명의 연구원 중에서 400명이 박사이고 600명 정도가 석사였습니다. 대부분 외국의 명문 대학에서 박사학위를 받았고 석사의 경우도 국내 최고의 대학들에서 최고의 성적으로 졸업한 분들이 대부분이었습니다. 학사 출신 연구원이 3명이었는데 그 중에 한 명이 저였고, 곧 유일한 한 사람이 되었더군요. 결코 자랑스러운 것은 아닌데, 그런 곳에 제가 입사한 것은 순전히 운이었습니다. 앞에서도 밝혔듯이 삼성항공에 공채시험을 보았고 (연구직도 아닌 생산 관련 분야, 고향이 삼천포라서 삼천포 옆에 있는 사천의 삼성항공에서 다녀야겠다는 목표), 당시 삼성항공에서 국방부가 주관하는 고등훈련기개발 사업자 선정이 연기되는 바람에 전 다른 곳에 가야 했지요. 당시 삼성항공 인사 담당자가 얼마나 난처했겠습니까? 저보고는 삼성종합기술원에 가라고 하더군요. 전 기술배우는 곳인 줄 알고 안 가려고 했는데 서울 근처라는 말에 가기로 했습니다. 마침 삼성종합기술원의 어느 신생 프로젝트 팀에서 인력을 한 명 늘려야겠는데(정치적, 전략적 이유입니다. 팀의 몸집 키우기. 팀의 연구성과가 좋으니까 가능하지요) 금속공학전공 인력이 급히 필요하다고 했고(명분), 그룹전체적 입장에서 삼성항공 신입사원 인력이 오버된 상태여서 제가 삼성종합기술원으로 가게 된 것입니다. 직장생활 해 보시면 이해하시겠지만, 정치적 전략적 이유에서 몸집 키우기 위한 팀의 장기 전략으로 인해, 무늬만 금속공학과인 제가 입사해서 일하는데는 별 어려움은 없었습니다. 실제 대학교 다닐 때, 2학년까지만 재료공학과에서 공부하고 3,4,5학년 때는 하고 싶은 공부만(93년 화학, 94년 물리, 95년 수학) 하다 졸업했기에, 일반적인 금속공학 전문가는 결코 아니었거든요. 물론 금속이 왜 금속이어야 하고 무엇이 금속의 위대한 점인지는 분명히 인식하고 있었습니다^^. 그 팀에서는 광디스크 개발 업무를 맡았습니다. CD를 굽는다는 표현을 사용하지요? 그런 CD-R, DVD-R 디스크를 개발하는 업무를 맡았습니다. 국내 최초로 CD-R을 자체 개발한 팀이었고, DVD-R의 경우는 일본 다음으로 개발한 능력을 가지고 있었지요. 업무철칙이라기 보다는 업무를 진행하면서 선호하는 방향이 있습니다. “살얼음 같은 완전성”은 싫다는 것입니다. 상대의 수준에서 원할 정도로만 대충해서(?) 빨리 마무리하면 “능력 있고 충실한 사원”이라는 신뢰를 상사로부터 듣게 되지만, 그게 결국은 자신의 영혼을 갉아 먹는다는 것을 오래 전부터 생각했습니다. 마치 학교 다닐 때 숙제 잘하고 시험 잘 쳐서 좋은 성적 나오면 그 과목을 잘 알고 있다고 착각할 수 있는 것과 비슷하다고 생각합니다.

5. 현재는 트리스 컨설턴트로 독립을 하셔서 <한국트리즈컨설팅> 대표로 활동을 시작하셨는데, 어떤 계기가 있으셨나요? 요즘은 어떤 일을 주로 하시고 계시는지요?

안정된 회사에서 높은 연봉을 받다가 갑자기 독립하는 것은 아주 쉬운 일이 아니겠지요. 저도 그런 배짱은 없었습니다. 하지만 지금이 독립하는 가장 좋은 타이밍이라는 것은 확신이 들었습니다. 점점 더 많은 회사에서 트리즈를 받아들여지는 시장상황은 저의 안테나로 입수가 되고 있었고, 5년 전부터 나가고 싶었지만 타이밍이 아니다 싶어 참고 있었는데 2007년 11월이 되니까, 최적의 타이밍이란 생각이 들더군요. 마침 어느 컨설팅 회사에서 회사재직시의 연봉을 보존해줄 테니, 같이 하고 싶은 일 재미있게 해보자고 하더군요. 모두가 사장이라는 작은 회사에서. 이 조건을 누가 거부하겠습니까? 하지만 작은 회사에 갔더니 몸이 너무 힘들었습니다. 큰 조직에서는 가끔 한 사람 빠져도 큰 문제가 없지만 작은 회사에서는 한 사람의 공백은 있을 수 없는 일이더군요. 그리고 작은 조직에서 한 사람이 5000의 연봉을 받으면 사장의 눈에는 5000만원 돈다발이 걸어 다니는 형국입니다. 그리고 5000만원의 지출이 있다면 1억5천의 이익을 가져와야만 회사가 운영될 것이니, 아주 고생이 훤해지는 겁니다. 사장 없는 회사가 있겠습니까? 그리고 누구나가 사장되면 다 그렇게 됩니다. 결론은 회사를 옮길 때는 더 큰 회사로 옮기는 것이 일반적으로 좋다는 결론이 내려지더군요. 그래서 좋은 기회가 있어 2달 만에 그만 두고, 독립하게 되었습니다. 계약서 같은 것을 만들지 않고 있었던 것이 행운이었습니다. 계약서에 사인할 시간도 없이 바쁘게 사람을 일하게 했으니 다행인지 불행이었는지……

지금은 기업을 고객으로 트리즈 컨설팅을 하고 있습니다. 트리즈 교육이 60%정도 되고 문제해결자문이 40%정도 되는데 2009년에는 문제해결자문을 70%까지 비중을 올리려고 합니다. 원한다고 되는 것은 아니지만, 시장의 바람이 트리즈를 향해 불고 있기에 편하게 갈 수는 있을 것 같습니다. 삼성은 오래 전부터 트리즈를 하고 있었고, 포스코는 물론 2008년도에는 현대자동차 그리고 미국의 GE도 트리즈를 대대적으로 진행하고 있습니다. 몸, 체력을 생각해서는 교육은 가끔씩 하는 것이 좋더군요. 그렇게 튕기면(?) 단가(?)도 좋아지고 교육의 질도 좋아지는 것 같습니다.

6. 대학시절 학생회장으로도 활동하셨다고 들었습니다. 학교에 계실 때 선배님은 어떤 학생이었다고 스스로 판단하시나요?

학생회장으로 활동했다는 것이 반은 맞고 반은 맞지 않습니다. 정확하게는 학과협(각 학과의 학생회장의 모임) 회장이었고 그 해에 총학생회장이 선출되지 않아 교칙에 의해 총학생회장 대행을 한 것입니다. 전 그 해에 총학생회장이 선출되었는지 선출 안되었는지도 모르는 불량(모범?)학생이었고, 대학본부의 학생지도 과장님이 학교 교칙 보여주면서 그리고 “대행”이라는 글자를 국어사전 찾아서 보여주고 해석해 주셔서 그런 줄 알았습니다. 왜 그렇게 멍청한 제가 학생회장이 됐는지 궁금하시다고? 92년 11월 겨울, 저희 재료공학과 91학번이 모여 93년도 학생회장을 선출하는데, 아무도 하겠다는 사람이 없더군요. 4년 졸업하고 2년 석사 마쳐서 병역특례로 회사 입사하는 모범코스에서 일탈하기 쉽기 때문이지만, 그래도 이 건 아니다 싶었습니다. “아니 우리 동기에서 대장 하나 못 뽑는다니, 아무도 하지 않겠다니?”라는 오기가 발동했을 뿐이고, 그래서 제가 하겠다고 손들었을 뿐이고. 그리고 해가 바뀌어 93년 3월이 되어 학과협 회의를 하는데 10개 학과의 각 학과 회장이 모두 모였습니다. 이번에는 학과협 대표를 선출하자고 하는데 아무도 손들지 않더군요. 제가 뭘 알았습니까? “아니 젊은이들이 이래서 되는가?” 싶어 내가 하겠다고 손들었을 뿐입니다. 그런데 당시 각 학과회장들이 왜 학과협 대표를 하지 않겠다고 했는지 나중에 알게 됐습니다. 90년도에 약간의 학내소요가 있었고 그 여파로 91년에 총학생회가 구성되지 않았고, 당시 학과협이 어용단체와 비슷하게 학생들의 차가운 시선을 받았다고 하더군요. 학과협 대표가 되면 총학생회장 직무대행을 하게 되고 여러 가지로 좋은 일은 없을 것은 자명하기에 아무도 나서지 않았는데, 전 그것도 모르고 그냥 “왜 이래?” 하면서 했을 뿐이고.

그래서 그런지 참 좋았습니다. 공약사항 내 건 것도 아니고, 학교에서 이래라 저래라 한다고 해서 쉽게 혹! 하지도 않았고… 당시 재료공학과의 김규영 학생생활담당 교수님이랑 잘 지냈을 뿐입니다. 여러 가지 일들을 많이 했던 것이 기억에 남습니다. 점심시간에 9시 뉴스 녹화해서 틀었던 일(워낙 뉴스를 안 보니까), 도서관 청소했던 일(자리 독점 하는 것 없애고 깨끗한 도서관을 위해), 봄 축제 가을 축제를 진행했던 일… 물론 봄 축제 가을 축제는 동아리연합이 주축이 되어서 한 일이었지만 저도 많이 도왔습니다(?). 워낙 생각이 없어서 그랬는지 모르지만, 가을 축제 때의 일이 생각납니다. 가을축제 전야제 행사에 노영심 씨의 갈라콘서트가 진행되었습니다. 학교측의 스케쥴에 의해… 그래서 동아리연합회 회원들이 3시간 마라톤 회의를 했습니다. 전야제 당일 오후 2시부터 5시까지…. 하지만 전 그 회의에 들어가고 싶지도 초대받지도 않았습니다. 중요한 문제가 아니라고 생각해서…. 결국 갈라콘서트 진행되고 이 후에 가을 축제 대동제 전야제 치루게 되었지요. 결국 그렇게 될 것이란 것을 당연히 예상한 것 같아요. 쓸데 없는 명분싸움은 세계가 멸망할 때까지 계속 될 것입니다^^.

그렇게 재료공학과 학생회장을 맡게 되면서 여러 일들이 엮어 들어 갔는데, 재료공학과 학생회장을 맡기로 한 그날 밤의 친구의 말은 마음에 상처가 되었습니다. “너라도 안 한다고 했으면 내가 하려고 했어” 라고 한 친구의 말. 왠지 모를 허망함과 아쉬움에 그 날 밤의 별들이 팍팍 가슴에 꽂히더군요. 그래도 그 덕분(?)에 학생회장을 하면서 만나게 된 다양한 학과의 학생회장들과의 친분은 인생에 있어서 큰 보람이 되었습니다. 다들 아시죠? Inter-disciplinary(학제간의 허물어지는 벽) 의 중요성!

7. 선배님에게는 자신만의 인생철학이 있다고 느껴집니다. 선배님의 인생 철학 또는 일에 관한 철학이 궁금합니다.

긍정적으로 살아가자는 것입니다. 사람들의 마음에 사랑이 있고, 결코 사람은 자기에게 필요한 것이 무엇인지 모르게 세상이 설계된 것 같습니다. 그래서 사람들은 서로 돕고 살아가게 되어 있지 않을까 생각합니다. 한 때, “이것이 중요해, 이것을 꼭, 반드시 해야 돼”라고 고집하지만, 지나고 나니 실제로 그 당시에 저에게 필요한 것을 그게 아니었다는 것을 느낍니다. 그 때 저에게 가장 필요한 것은 나를 아끼는 다른 사람이 해 주는 충고에 들어있었습니다. 그런 충고는 쉽게 하지 않습니다. 정말 안타까워서 합니다. 그런 말에 귀 기울이는 긍정적인 자세가 중요하다고 생각됩니다.

8. 책을 만드실 때도 아내분의 도움이 컸다고 들었는데, 사랑하는 가족 소개 부탁드립니다.

아내가 있는데 아내가 출판사 사장입니다. 초창기에 책들의 재고관리가 안될 때(아파트 베란다에 쌓아놓았는데) 술값이 필요하면 한 박스 몰래 어깨에 매고 출근합니다. 덤핑처리하고 술값으로 지불했던 적이 많네요. 아기도 둘 있습니다. 하나 더 낳고 싶지만, 제가 하는 일이 아니라서…^^

9. 지금 가지고 있는 또 다른 꿈은 어떤 것인지 궁금합니다.

지금 가지고 있는 꿈은 포르쉐 GT3-RS 차량을 구입하는 것입니다. 궁극의 차량이라서… 그리고 그 꿈이 이루어져서, 5년만 타고 다니다가, 그 차를 팔고, 다시 삶을 검소하게 살아보고 싶습니다. 그렇게 해서 남는 재물들은 좀 더 의미 있고 보람된 곳에 사용하고 싶습니다. 구체적으로 말하기는 부끄럽습니다. 아직 실천한 것도 아니고….

경 력

前)삼성종합기술원 CTO전략팀, 연구혁신그룹(1997~2008, 삼성SDI 기흥 연구분소 소속)

前)삼성그룹, 6시그마아카데미 MBB양성과정 트리즈 담당

트리즈 도서, “생각의창의성” 집필(도서출판 지혜 2004)

트리즈 도서, “창의성의 또 다른 이름 TRIZ” 집필(북스 인피니티 2008)

2001년 일본 트리즈 학회, 초청발표

2001년 유럽트리즈 학회, ETRIA, Invited Speaker

2002년 www.trizjournal.com 논문게재(국내최초) 등

자격증

국제트리즈협회 인증, 트리즈Specialist Level4 (국내 최초)

포항공과대학교 금속공학과 학사

삼성종합기술원 MBB/TRIZ

강의/

컨설팅 분야

트리즈교육 문제해결자문 , 실험계획법 교육 및 자문, Technology Roadmap, Technology Tree,

Six sigma 강의 및 자문

Ref.

http://alumniwebzine.tistory.com/111

유전자 염기서열을 이용한 종 감별

Acidrain — Sat, 12 May 2012 14:48:15 +0900

많은 생물들이 진화를 계속해 오는 과정에서도 변화가 가장 적고 안전하게 유전적 특성이 유지되는 rDNA (Ribosomal DNA)의 염기서열의 비교연구는 넓은 범위의 분류수준에서 유연관계를 분석하는데 가장 유용하다. 진핵 세포의 rDNA는 코딩영역과 비코딩영역으로 구성되어 있다.

또한 rDNA는 진화에 보존적인 영역과 다른 영역보다 빠르게 진화하는 ITS(Internal transcribed spacer)영역 IGS(Intergenic spacer)영역이 있는것으로 알려져 있다.

SSU rDNA(Small-subunit rDNA sequences)는 느리게 진화하므로 계를 연구하는데 유용하지만 미토콘드리아 rDNA는 더 빠르게 진화하므로 과의 분류에 이용될 수 있다.

ITS와 IGS영역은 각각 다른 비율로 진화하며 구조와 특징이 규명되었다. rDNA의 코딩영역은 진화에 보존적이지만 비코딩영역은 종간에 다양성이 있다.

진핵세포의 rRNA유전자 (rDNA)의 전사단위는 18S, 5.8S, 28S의 순으로 되어 있으며 각각의 rDNA사이에 2개의 ITS영역으로 분리, 연결되어 있다.

ribosome은 rRNA 분자들과 단백질로 구성되어 있다. 이 rRNA 분자들은 원핵이나 진핵에서 그 크기가 다르다. 그들의 크기는 S값으로 나타내져 있다..(S는 Svedberg단위로서 S값은 분자의 크기와 비례한다.) 원핵세포의 ribosome은 23S, 18S, 5.8S, 5S rRNA 분자들을 갖고 있고 진핵의 세포성(소기관에서는 존재하지 않음) ribosome은 28S, 16S, 5S rRNA 분자들을 갖고 있다. 여기서 말하는 진핵은 고등진핵세포의 ribosome을 의미한다.

ribosomal RNA는 세포내에서 단백질을 합성하는 ribosome을 구성한다. 진핵 및 원핵 세포에서 ribosome에서 일어나는 대부분의 과정들은 거의 같고 다른 것은 크기이다. 진핵 및 원핵 세포의 ribosome들은 매우 비슷하게 구성되어져 있다. 진핵생물에서 rRNA는 다른 RNA와 달리 인에서 전사된다. 전사에 관여하는 DNA는 인 형성부위에 있으며 이 부위에는 rRNA에 관여하는 여러 사본의 유전자가 있다. 이와 같이 많은 수의 똑같은 유전자가 필요한 이유는 때에 따라 rRNA의 요구량이 많아지기 때문인 것으로 생각된다. 따라서 많은 양의 rRNA가 요구될 때에는 많은 수의 RNA 중합효소가 이들 유전자들을 따라 이동하면서 계속 RNA를 만들어 낼 수 있다.

초기에는 5.8S 부위에 대한 염기서열의 비교가 분류의 근거로 주로 이용되었다. 그러나 이 부위는 염기서열 길이가 상당히 짧고 매우 보존적인 부위이기 때문에 관련된 종 간에는 거의 동일한 염기서열을 나타내므로 이 들 상호간의 분류네는 사용할 수 없는 어려움이 있다.

분자생물학적인 실험 기법의 발달과 더불어 다른 고등 균류 사이에서의 계통분석에 18S rDNA염기 서열을 이용하고 있다. 18S 및 28S rDNA는 통계적으로 신뢰성이 있는 정보를 가지고 있으며 염기 보전이 높은 부분 중간 부분 변이가 심한 부분이 공존하므로 계통분화를 논하는데 적합한 수단으로 취급되었다.

그러나 18S와 28S는 염기서열 길이가 길어서 염기서열을 결정하기 위해 많은 시간과 노력을 요구하고 부분염기서열은 보다 광범위한 계통발생학적 진화관계를 가지는 속간의 비교에는 대상으로 하는 염기서열의 부족으로 분류지표로 이용될수 있는 정보량이 적은 난점이 지적되었다.

반면에 ITS영역은 가운데의 5,8S부분을 포함하여 500~800bp 정도로 그 염기서열을 결정하기가 간편하고 시간적 제약을 덜 받기 때문에 다수의 균종을 대상으로 하는 분류학적 연구에 적합하며 그 분자진화 속도가 빨라 염기서열의 다양성을 요구하는 종, 속의 분류에 적합하다. 더구나 보존성이 높은 5.8S부위를 포함하고 있으므로 ITS부위와의 각각의 비교가 가능하며 이러한 풍부한 정보량과 간편성으로 동일 속 내의 종 간 및 속 간의 유연관계의 연구에 유용한 수단이 되어왔다. 또한 계통의 분석을 위하여 이용될수 있다.

식물에서의 완성된 rRNA는 그들의 크기와 기능장소를 통하여 특징지어진다. Cytosol 에는 25S-, 5,8S-, 그리고 5S- 형이 리보솜에 큰 subunits로 존재하고, 18S-형이 작은 subunit로 존재한다. 미토콘드리아 속에는 24S-, 5S-가 큰 subunit로 18S-형이 작은 subunit로 존재한다.

DNA를 증폭하여 진단에 사용하려면 유전자의 어느 부위를 목표로 하느냐가 가장 중요하며 유전자의 복제 수(copy number),증폭할 부위의 크기, 특이성 등을 고려하여야 한다. 목표로 하는 유전자가 다복제(multi-copy)인 경우 단복제(single-copy)보다 감수성이 높다.

진균의 경우, 종특이 primer4,5는 여러 균종에 오염된 경우 유용하며 특이성이 높다. 그러나 대부분 단복제이므로 감수성이 낮 고 , 균종마다 특이primer/probe를 만들어야 하는 번거로움이 있으며, 알려져 있지 않은 균종에 대해서는 검사를 시행하지 못하는 단점이 있다. 모든 진균을 검출할 수 있는 범진균 (universal fungal) primer를 이용하여 진균 DNA를 증폭 후 염기서열을 분석하거나, 종특이 표식자(species-specific probe)를 사용하여 균종을 구분하는 것이 임상적용에 적합하다.

Ribosomal RNA gene (rDNA)의 ITS 부위는 종특이 probe를 제작하는데 알맞다(그림 1). 5종의 Candida에서 5.8S와 18S의 상동성은 평균 97%로 비교적 차이가 없는데 비해,6,7 ITS2의 3' 부위는 40%의 상동성을 나타냈으며, 동일균종내 균주간에는 차이가 없었다. Duggal 등8은 6종의 Fusarium에서18S와 28S에 비해 ITS에 더 많은 다형성(polymorphism)이 있으며, ITS 부위의 염기서열을 비교하여 균종간에 차이가 많음을 밝혔다.

효모균에서는 염기서열의 변이가 심한 ITS1에 비해 ITS2 부위가 균동정에는 적합하다고 한다.

>>Arrangements of rRNA gene repeating units in yeast. rDNA is transcribed to rRNA precusor. ETS and ITS are removed by endonuclease and splicing. 18S and ribosomal proteins become SSU. 5.8S, 28S and 5S become LSU. NTS is not trascribed, and includes promoter and enhancer. Intergenic spacer(IGS) include NTS and ETS. NTS : Non Transcribed Spacer; ETS : External Transcribed Spacer; ITS : Internal Transcribed Spacer; SSU : Small Sub Unit of ribosome; LSU : Lage Sub Unit of ribosome

증폭된 DNA의 염기서열을 알 수 있으면 가장 많은 정보를 얻을 수 있는 장점이 있지만 시간과 비용이 가장 많이 든다. ITS 부위 염기서열 분석이 균종의 동정에 많이 이용되고 있다. 다양한 균종들의 ITS 염기서열이
보고되어 있으며, 미지의 균을 동정하기 위하여 범진균 특이 primer로 ITS 부위를 PCR 증폭한 후 염기서열을 BLAST (basic local alignment search tool)를 이용하여 GenBank database와 비교하면 균종을 동정할 수 있다.

Genomic DNA란?
어떤 생물종의 전체DNA를 Genomic DNA라고 함, Plasmid DNA , cDNA와 구분하여 사용하는 말.
(예) 인간일경우 : 23개의 염색체 세트를 genome이라 함

Gene(유전자)란?
유전자란 말은 DNA 중에서 단백질로 정보가 표현되는 부분을 말하는데, 정의를 내리자면, 한 세대에서부터 다음 세대로 그 개체의 모든 생물학적 정보를 전달해주는 물리적, 기능적인 단위

Plasmid DNA란?
Plasmid는 박테리아 세포 내에 독립적으로 존재하는 환형의 DNA 분자

Primer?

염기쌍 형성에 의해 단선 주형분자에 부착될때 DNA polymerase에 상보 strand의 합성의 시작부분으로 작용하는 oligonucleotide

Vector?

유전공학에서 재조합 DNA를 세포내로 운반하는 전이체. 플라스미드와 박테오파지가 주로 이용

생명체들의 진화적 차이 및 서로간의 상관관계를 비교하기 위해서는 현재 원핵생물들은 16S rRNA의 염기서열, 그리고 진핵생물의 경우에는 18S rRNA의 염기서열을 비교하고 있다.

▣ Base-pair : The size of an individual gene or an organism's entire genome is often measured in base pairs because DNA is usually double-stranded. Hence, the number of total base pairs is equal to the number of nucleotides in one of the strands (with the exception of non-coding single-stranded regions of telomeres). The haploid human genome (23 chromosomes) is estimated to be about 3.2 billion base pairs long and to contain 20,000–25,000 distinct genes.^[1]^[2]^[3] A kilobase (kb) is a unit of measurement in molecular biology equal to 1000 base pairs of DNA or RNA

▣18S ribosomal RNA (abbreviated 18S rRNA) is a part of the ribosomal RNA. The S in 18S represents Svedberg units. 18S rRNA is a component of the small eukaryotic ribosomal subunit (40S). 18S rRNA is the structural RNA for the small component of eukaryotic cytoplasmic ribosomes, and thus one of the basic components of all eukaryotic cells.It is the eukaryotic nuclear homologue of 16S ribosomal RNA in Prokaryotes and mitochondria.The genes coding for 18S rRNA are referred to as 18S rDNA. Sequence data from these genes is widely used in molecular analysis to reconstruct the evolutionary history of organisms, especially invertebrates, as its slow evolutionary rate makes it suitable to reconstruct ancient divergences

디엔에이(DNA) 바코드 마커로서 ‘리보솜 디엔에이(DNA) 아이티에스(ITS, internal transcribed spacer)가 활용된다.

○ 디엔에이(DNA) 바코드란 사람의 지문처럼 종간 변이가 커서 종을 구분하는데 사용되는 디엔에이(DNA) 염기서열 부위로, 이를 이용 하면 생물종의 이름, 서식지, 습성 등과 같은 생태정보를 쉽게 알아낼 수 있다.

○ 동물은 미토콘드리아에 있는 ‘시토크롬산화효소1(CO1)’ 유전자가, 식물은 엽록체에 있는 ‘matK(MaturaseK), rbcL(Rubisco large)’두 개의 유전자가 디엔에이(DNA) 바코드 마커로 선발돼 사용되고있 다.

▣ITS (for internal transcribed spacer) refers to a piece of non-functional RNA situated between structural ribosomal RNAs (rRNA) on a common precursor transcript. Read from 5' to 3', this polycistronic rRNA precursor transcript contains the 5' external transcribed sequence (5' ETS), 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA and finally the 3'ETS. During rRNA maturation, ETS and ITS pieces are excised and as non-functional maturation by-products rapidly degraded. Genes encoding ribosomal RNA and spacers occur in tandem repeats that are thousands of copies long, each separated by regions of non-transcribed DNA termed intergenic spacer (IGS) or non-transcribed spacer (NTS).

**원핵생물과 진핵생물의 비교**
	원 핵 생 물	진 핵 생 물
소속 생물의 예	Bacteria, Archaea	Algae, fungi, protozoa, plant animal
1. 핵 구조와 기능
핵막	없음	있음
인	없음	있음
DNA	하나의 분자: histone과 연결 안됨	여럿 또는 많은 염색체로 존재. Histone과 복잡한 결합
분열	무사분열	유사분열
유성생식	절단과정:감수분열 없슴	정상과정:감수분열;염색체의 보충
Introns in genes	Rare	Common
2. 세포질 구조와 구성
원형질막	보통 sterol이 없음	보통 sterol이 있음
내부막	비교적 간단: mesosome	복잡: 소포체(ER), 골지체
리보소옴	70S의 크기	80S(미토콘드리아 리보오솜:70S)
세포내 소기관	없음	액포, lysosome, microbodies
호흡계	원형질막 부분, 메소소옴	미토콘드리아
광합성기구	내부막 또는 액포	엽록체
세포벽	대부분 있음(peptidoglycan)	식물, 조류, 곰팡이:있음, 동물, 원생동물:없슴
내생포자	약간 있음:내열성	없음
공포	약간 있음	없음
3. 운동형
편모운동	편모:현미경으로 관찰 안됨, 회전	편모 또는 섬모:현미경 관찰, 회전하지 않음
비편모성 운동	미끄러움 운동	세포질 유동돠 아메바 운동
4. Microtuble	아마 없음	널리 분포:편모, 섬모, 기부, 방추사, 중심체
5. 크 기	일반적으로 작음, 보통 <2 μm 직경	보통 큼, 2~100 μm 직경

실험방법은 Ref 3.의 실험법을 참고...자세히 설명되어 있어 매우 유익함.

>> PCR (polymerase chain reaction) <<

DNA의 증폭을 위해서 PCR이 많이 이용된다.

1. 반응조건
PCR은 통상적으로 다음 세 가지 반응단계로 이루어져 있다

(1) DNA변성(Denaturation)
일반적으로 두가닥 DNA를 94℃에서 15~30초간 처리하 여 각각 한가닥 DNA로 분리시킨다. 너무 온도를 높이거
나 처리시간을 지나치게 늘리면 내열성 DNA polymerase라 해도 활성을 잃게되므로 주의가 필요하다.

(2) Primer의 Annealing
열처리로 한가닥으로 변성한 DNA와 primer를 공존시킨후 온도를 낮추면 2종류의 primer는 각각 상보적인 한가
닥 주형 DNA에 annealing한다. Annealing에 가장 적합한 온도와 시간은 primer의 염기배열과 그 길이에 따라 결정되지만 일반적으로 55℃에서 30초~1분간 annealing한다. Annealing 온도를 높이면 primer-주형 DNA의
mismatch가 감소되어 반응 특이성이 높아진다. 그러나 혼합 primer 또는 mismatch를 갖는 primer를 사용할 경우는37~45℃로 annealing 온도를 낮출 필요가 있다.

(3) 신장반응(Extension)
4종류의 기질(dNTP)이 공존하는 상태에서, DNApolymerase를 작용시켜 primer를 신장시킨다. 신장반응
에 필요한 시간은 주형 DNA의 농도, 증폭단편의 크기, 반응온도에 따라 좌우되지만 일반적으로는 Thermus
aquaticus(Taq) polymerase를 사용할 경우 72℃에서30초~10분간(증폭크기 약 10 kbp)처리한다. Taq polymerase에 의한 DNA 합성속도(약 60 nucleotides/sec, 70℃)1)를고려하여 시간을 설정한다.최근 primer의 annealing 단계, 신장반응 단계를 동일한온도에서 하는 shuttle PCR도 실행되고 있다.

예) 94℃ 30초 (변성단계)
60~68℃ 1~10분(annealing, 신장단계)
25~40 cycles
Shuttle PCR을 함으로서 반응

(4) Cycle 수
PCR의 경우 n회의 cycle로 표적배열은 2n배가 되지만 실제로는 이보다 낮다. 효율이 저하되는 이유는 ① DNA
polymerase의 실활 및 증폭단편(주형DNA)의 증가로 인한 효소분자/주형비의 부족, ② 증폭단편간의annealing되는 속도가 빨라져서 primer의 anneal과 경합한다, ③ Pyphosphate 축적으로 인한 효소반응 저해 등이 일어날 수 있다. 일반적으로 25~35 cycles의 반응이 이루어지지만 증폭산물이 증가되면 그 자신이 primer가 되어 2차적인 반응이 일어나기 쉬우므로 비특이적인 DNA의 증폭을 일으키게 된다. 따라서 반응 cycle 수를 불필요하게 증가시키는 것은 바람직하지 않다. 물론 반응개시의 경우 주형 DNA량이 미량일 경우에는 일반적인 경우보다 cycle 수를 늘릴 수 있다. 최근에는 1 copy로부터 PCR도 가능하게되었다. 이 경우는 단지 반응 cycle수를 증가시키는 것이아니라 nested PCR을 실행한다. 이것은 1회째의 PCR산물을 희석하여 주형으로 삼고 primer의 안쪽에 설정된 다른 primer를 사용하여 2회째 PCR하는 것이다. 또한random primer를 사용하여 주형 DNA를 증폭하는primer extension preamplification(PEP법)이 고안되었다2). 이것은 시료 DNA를 주형으로 하여 우선 임의의 서열을 갖는 짧은 primer(9~15 mer정도)를 사용한 비특이적인 신장반응으로 주형 DNA의 거의 모든 영역을 증폭한 다음 그 일부를 주형으로 하여 1회 더 primer 특이적 PCR을 하는 것이다.

2. 반응액의 조성
(1) 내열성 DNA Polymerase
수 종류의 내열성 DNA polymerase가 시판되고 있는데 반응에 사용하는 완충액의 조성이 다를 수 있으므로 주의가 필요하다. TaKaRa Taq을 사용할 때 DNA합성의 최적온 도 는 대 개 70~80℃ 이 고 그 합 성 속 도 는 60
nucleotides 이상/초이다. 활성 반감기는 92.5℃에서 130분 이상, 95℃에서 약 40분, 97.5℃에서 약 10분간이다.

(2) Mg2+ 농도
일반적으로 PCR반응에서는 1.5~2.5 mM의 Mg2+ 농도가 필요하다. Mg2+ 농도는 PCR을 실행할 때 다음의 사항에 관여하고 있는 것으로 여겨진다. ① 효소활성, ②primer의 annealing, ③ 합성된 DNA의 충실성, ④primer-dimer의 형성 등이다. 킬레이트제(예를 들면EDTA)는 반응액 속의 Mg2+ 농도에 영향을 미치므로 주형으로 사용하는 DNA 용액에서 turn over하는 것에 주의할 필요가 있다. 또한 유효한 Mg2+ 농도는 dNTP 농도와도 관계가 있으므로 어느 실험에서나 최적 Mg2+ 농도를 결정하고자 할 경우 항상 dNTP 농도를 고려해야 한다. 일반적으로 Mg2+ 농도가 높아지면 DNA 합성의 정확도에 영향을 미칠뿐만 아니라 두가닥 DNA 변성이 어려워지고, Taq
polymerase는 10 mM MgCl2에 의해 40~50%의 저해를 받으므로 MgCl2를 과잉 첨가하는 것은 바람직하지
않다.

(3) dNTP
PCR의 효율, 특이성면에서 보면 20~200 μM에서 양호한 결과를 얻을 수 있다. DNA polymerase가 잘못된 dNTP를 사용하는 mismatch 현상은 dNTP 농도에 강하게 의존 한다3,4). dNTP 농도를 낮추는 쪽이 PCR 특이성과 정확도가 높아지므로 dNTP 농도를 낮추면 misprimming이 감소하여 PCR의 정확도가 높아진다5). 단 사용하는 Mg2+ 농도에 따라 dNTP의 최적농도가 달라지므로 주의가 필요하다.

(4) 주형 DNA, RNA
PCR법은 여러 가지 형태의 DNA와 RNA를 주형으로하여사용할 수 있다. 가장 간편한 DNA 조제법으로는 소수의
조직배양 세포를 비등한 증류수 속에서 가용화하여 PCR에 사용하는 방법이다6). 또한 사람의 한 가닥의 머리털로부터 PCR 증폭하는 다형분석7), 포르말린으로 고정한 파라 핀포매조직 조작으로 PCR도 실시하고 있다8,9). 혈액에서 주형 DNA를 조제할 때는 헤모글로빈이나 포르피린 기타 미지물질이 PCR 반응을 저해하는 점에 주의가 필요하다.

10). 최근 법의학 분석에서 전혈 또는 머리털을 마이크로파처리하여 그대로 PCR에 이용한다는 보고도 있다11). 주형 DNA 양으로는 1단계 PCR에서 105~106 분자에 상당하는 양이 있으면 양호한 결과를 얻을 수 있고 3×105개의 분자는 human genome DNA에서는 1 ㎍, 효모 DNA에 서는 10 ng, 대장균 DNA에서는 1 ng에 상당한다. 그러나 앞에서 기술한 바와 같이 nested PCR, PEP법을 이용하면 1분자 DNA로부터의 PCR도 가능하다. RNA를 우선 역전사 효소로 cDNA로 변환한 후에 PCR을 하는 방법을 일 반 적 으 로 RT-PCR(Reverse Transcription-
Polymerase Chain Reaction)이라 한다. 소수의 세포로 부터의 mRNA 또는 극히 미량밖에 발현되지 않은 mRNA
의 검출, 반정량에 사용할 수 있다. 또한 RT-PCR은 임상시료에 따라 다수의 세포를 얻기 어려운 경우, 소수의 세포로부터 완전한 cDNA cloning 하는데도 유용하다. RTPCR용 시료의 정제용으로 Catrimox-14는 양이온 계면활성제로서 세포를 용해하여 RNA와 DNA 복합체를 형성한 이 복합체에서 간편한 방법으로 보다 효율 좋게 RNA
를 회수할 수 있고, 또한 Catrimox-14는 ribonuclease 저해작용을 하기 때문에 혈액,14) 동물 배양세포,15) 동물 조직으로부터의 RNA 추출에 매우 유효하다.

(5) 반응첨가물
많은 염기배열을 복수의 primer set를 사용하여 동시에 1개의 반응 tube 내에서 PCR 증폭하는 방법을 다중
PCR(multiplex PCR)이라 한다. 근육병의 원인인 디스트로핀 유전자의 결실변이를 18종류의 primer를 사용하
여 검출할 수 있다16). 일반적으로 multiplex PCR반응액에는 10%(v/v) dimethylsulfoxide(DMSO)를 함유한다
17). 유기용매는 보통 Taq polymerase에는 적합하지 않지만 multiplex PCR에는 필수적이다.
Taq polymerase의 저해물질로서 SDS(<0.01%)가 알려졌으나, 비이온 계면활성제 Tween-20이나 nonidet-P40
의 첨가로 그 저해를 억제할 수 있다. 또한 DMSO(2~5%),PEG6000(5~15%), 글리세롤(5~20%), 포름아마이드
(5%)나 BSA(bovine serum albumine)첨가로 반응 촉진효과를 얻을 수도 있다.

PCR로 증폭된 DNA를 바로 sequencing하기에는 정확한 결과를 얻기 힘들다. 기본적으로 PCR산물은 순도가 높지 않다. 따라서, 원하는 부위를 선별해서 이 부위를 증폭해야 하는데 이떄 cloning과정을 거치게 된다.

Vector cloning기법을 쓰게 되는데 vector의 기능은 다음과 같다.

1) 세포내에서 자가 복제를 한다.

2) 항생제를 이용한 선택이 가능하다.

3) MCS(multiple cloning site)를 이용할 수 있다.

4) Vector부위를 이용한 DNA sequencing, 단백질 발현등을 할 수 있다.

Vector의 종류는 다음과 같다.

1) Plasmid

2) Bacteriophage

3) Cosmid

4) Phagemid

Ref